(Забарвлення за Цилем-Нільсоном)

При дослідженні молока 30 мл його наливають в стерильні флакони з вузьким горлом ємкістю 100 мл і додають рівну кількість 5%-ного розчину їдкого натра. Суміш струшують протягом хв., а потім флакони ставлять у водяну баню при температурі 50-60 ºС на 1год. Потім до вмісту флакона додають 1 мл ксилолу, і знову струшують протягом 15 хв. в шуттель-апараті. Після струшування у флакон додають дистильовану воду, поки його вміст не підніметься до вузької частини шийки. Після відстоювання протягом 1-2 год. у ньому утворюється вершкоподібне кільце; 3-4 краплі з нього наносять пастерівською піпеткою на злегка підігріте предметне скло. У міру підсихання наносять на предметне скло по 3-4 краплі ще 2-3 рази, щоб отримати товстий мазок. Мазок висушують в сушильній шафі, знежирюють ефіром, фіксують на полум'ї, забарвлюють по Цилю-Нільсену і мікроскопіюють.

Для отримання культур мікобактерій роблять посіви на живильні середовища (Петраньяні, Гельберга і ін.). Кожен матеріал висівають на 5-10 пробірок із середовищем. Пробірки заливають розплавленим парафіном. Посіви переглядають не рідше за один раз на тиждень і витримують в термостаті не менше трьох місяців. У разі відсутності росту з поверхні середовища роблять зскрібок платиновою петлею, готують мазок для бактеріоскопії і у разі виявлення в нім мікобактерій роблять посів на свіже середовище.

Для біологічного дослідження використовують той же матеріал, який був приготований для посіву, а наявність в ньому сірчаної кислоти нейтралізують 10%-ним розчином двовуглекислої соди.

Заражають кроликів, трьох морських свинок і ведуть за ними спостереження.

Диференціальна діагностика. Мікобактерії розрізняються між собою за швидкістю і характеру зростання на живильних середовищах, по морфології, по патогенності і іншим властивостям. Раніше визначення вигляду їх називали типуванням, оскільки вони ділилися на типи. Для визначення виду мікобактерій туберкульозу запропоновано немало методів: бактеріоскопічний, культуральний, біохімічний і т. д.

Для визначення вигляду найчастіше використовують біологічний метод. З цією метою ставлять біопробу на трьох морських свинках і трьох кроликах, а якщо необхідно, то і на трьох курях. Культуру мікобактерій вводять тваринам в дозі 1мг сирої бактерійної маси, суспендованої в 1мл стерильного фізіологічного розчину, морським свинкам підшкірно в області паху, кроликам - внутрішньовенно в краєву вену вуха, курям - в підкрильцеу вену. У морських свинок при розвитку туберкульозного процесу через 2-4 тижні на місці введення культури утворюється виразка, а також збільшення і ущільнення регіонарного лімфатичного вузла. Свинки прогресивно худнуть. У кроликів і курей при розвитку туберкульозу спостерігають виснаження і зниження апетиту.

Через три місяці морських свинок, курей і кроликів вбивають, розкривають і проводять бактеріологічне дослідження паренхіматозних органів.

Приналежність досліджуваної культури до того або іншого вигляду визначають за такими даними:

- при генералізованному процесі у морських свинок і кроликів - M.bovis;

- при генералізованном процесі у морських свинок, а у кроликів відсутність поразки або одиничні вогнища в легенях - M. tuberculosis;

- при генералізованном процесі у курей і сепсисі у кроликів - M.avium.

М.М. Іванов і Л.В. Кирилов запропонував для визначення M.avium досліджувану культуру вводити двом курям внутрішньошкірно в борідку в дозі 0,1 міліграм. На місці введення M.avium викликають припухлість, а до 25 - 30-го дня – виразку. Іноді спостерігається перфорація борідки.

Серологічна діагностика. Для цієї мети використовуються реакції преципітації, аглютинації, дифузної преципітації, зв`язування комплементу, гемаглютинації і гемолізу. Реакція преципітації і реакція аглютинації у ссавців тварин виявилися неефективними. Лише у курей кровокрапельна реакція аглютинації дала надійні результати.

Найбільш вивчена реакція зв`язування комплементу (РЗК). Її застосовують як додатковий метод при відборі тварин для діагностичного забою серед тих, що реагують на туберкулін. У РЗК велику роль грає якість антигена. Кращим з них раніше рахували метиловий антиген Негр і Боке. Останніми роками ефективніші були визнані складнозмішаний антиген ТА. Луценко і комплексний антиген Ю.Я.Касіча. У основу складнозмішаного антигена був узятий полісахарідний комплекс, отриманий з мікобактерій туберкульозу. До складу комплексного антигена Ю.Я. Кассича входить полісахарідний комплекс, метиленовий екстракт туберкульозних мікобактерій і водний екстракт легеневої тканини здорової великої рогатої худоби.

Для постановки реакції досліджувані сироватки інактивують у водяній бані при t=60ºC протягом 30 хв. Антиген і комплемент титрують. У пробірки розливають випробовувані сироватки в розведеннях: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 і 1:80 по 0,25мл і додають антиген і комплемент теж по 0,25мл. Потім штативи з пробірками ставлять на 30 хв. у водяну баню при t=37 - 38ºC, потім виймають і додають в кожну пробірку гемолітичну систему, яка складається з 0,25 мл 2%-ной суспензії еритроцитів барана і 0,25 мл гемолізину в робочому титрі. Потім штативи знову поміщають у водяну баню на 15 хв. Реакцію враховують заздалегідь після бані і остаточно через 16-18 годин. Оцінку проводять по затримці гемолізу. Отримання позитивної РЗК в титрі 1:20 і вище указує на наявність у тварини туберкульозного процесу.

Реакцію гемагглютінації запропонував Мідлбрук і Дюбо. Суть її полягає в тому, що антиген, що міститься у витяжках мікобактерій, володіє здатністю адсорбуватися на поверхні еритроцитів і сенсибілізувати їх до сироватки крові туберкульозних тварин, яка викликає аглютинацію таких еритроцитів.

Реакція гемолізу полягає в тому, що після обліку реакції гемаглютінації в кожну пробірку додають комплемент. У пробірках, де містилася сироватка туберкульозних тварин, наступає гемоліз.

Алергічна діагностика. У тварин, заражених туберкульозом, через 15-20 днів з'являється алергія, що виражається підвищенням чутливості до продуктів життєдіяльності мікобактерій (токсинам).

Впродовж багатьох років для алергічної діагностики застосовували тільки альттуберкулін Коха. В даний час у тварин і птахів застосовують альттуберкулін і сухий очищений туберкулін (ППД - протеїн пуріфієд дериват).

Альттуберкулін готують на біофабриках, вирощуючи культури мікобактерій туберкульозу бичачого і людського вигляду на м'ясо - пептонному гліцериновому бульйоні протягом 6-8 тижнів, після чого культуру збовтують і стерилізують в автоклаві при 120ºС 30 хв., а потім випаровують при 80-90ºС до 1/10 первинного об'єму, відстоюють і фільтрують через фільтр Зейтца. Отриманий таким чином туберкулін прозорий, коричневого кольору, має специфічний запах. Він містить близько 40-50% гліцерину.

ППД готують, вирощуючи культури мікобактерій туберкульозу на синтетичному середовищі. У фільтрат 8-тижневої культури додають трихлороцтову кислоту для осадження протеїнів. Осад обробляють, очищаючи від слідів цієї кислоти і висушують. Отриманий препарат є аморфною масою, світлого коричневого кольору з сіруватим відтінком. До сухого очищеного туберкуліну біофабрики випускають розчинник, який є безбарвною прозорою рідиною. Туберкулін і розчинник випускають в ампулах і флаконах.

Застосовують туберкулін для внутрішньошкірної і очної проби.

Для внутрішньошкірної туберкулінізації тварин (окрім свиней і мавп) застосовують сухий очищений туберкулін або альттуберкулін для ссавців, для свиней - одночасно сухий очищений туберкулін для ссавців і птахів, птахам - сухий очищений туберкулін для птахів. Враховують реакцію у ВРХ, буйволів, верблюдів через 72 год. після введення препарату; у кіз, свиней, собак, хутрових звірів через 48 год., а у птахів через - 30-36 год. У тварин реакція на місці введення туберкуліну виявляється у вигляді розлитого набряку щільної або м'якої консистенції, що не має, як правило, чітких меж з навколишньою тканиною, супроводжується місцевим підвищенням температури, а іноді хворобливістю. При обліку реакції місце введення препарату пальпують, а при виявленні зміни товщину шкірної складки вимірюють кутіметром, порівнюючи її з товщиною складки незміненої шкіри поблизу місця введення туберкуліну. Велику рогату худобу, верблюдів і оленів вважають за тих, що реагують на туберкульоз при потовщенні шкірної складки на 3мм і більш; кіз, овець, собак, свиней, хутрових звірів - при утворенні припухлості в місці введення туберкуліну.

Очну туберкулінізацію (офтальмопробу) застосовують у коней, іноді – у великої рогатої худоби одночасно з внутрішньошкірною пробою. Її проводять двократно з інтервалом в 5-6 днів. Очною піпеткою на кон'юнктиву нижньої повіки наносять 3-5 крапель туберкуліну. Враховують реакцію через 6, 9, 12, 24 год. після першого і через 3, 6, 9, 12 год. після другого введення. Реакція виражається у виділенні слизово-гнійного або гнійного секрету і гіперемії кон'юнктиви.

Імунітет та лікування. При туберкульозі він нестерильний і триває до тих пір, поки в організмі знаходяться живі мікобактерії туберкульозу. Роль живих бактерій туберкульозу в походженні імунітету виявив Р. Кох у досліді повторного зараження хворих туберкульозом морських свинок. При їх первинному зараженні туберкульозними мікобактеріями під шкіру на місці ін`єкції через 10-14 днів утворюється виразка, яка не заживає до загибелі тварини. При повторній інокуляції (через 4-6 тижнів) тієї ж культури ділянка шкіри в місці ін`єкції через 1-3 доби некротизується, відторгається і утворюється досить швидко заживаюча, на відміну від первинної, виразка. Цей дослід був названий феноменом Коха.

Механізм імунітету при туберкульозі до кінця не вияснений. Значна роль в захисті організму від розвитку інфекції належить Т-лімфоцитам, тканинним елементам, які утворюють специфічні бугорки (епітеліоїдні, гігантські та лімфоїдні клітини). Бугорок може інкапсулюватися і ущільнюватися, що призводить до руйнування мікобактерій, які містяться в ньому. Однак фагоцитоз має незавершений характер і фагоцитовані мікобактерії не гинуть.

Специфічна профілактика. Вакцину проти туберкульозу запропонували в 1924 р. французькі вчені Кальметт і Герен. Протягом 18 років вони культивували штам бичачих туберкульозних паличок на картоплі, просоченій бичачою жовчю з 5% гліцерина. В результаті 230 пересівів культури, яка безперервно піддавалась впливу жовчі, ці автори отримали стійкий варіант з певними біологічними властивостями. Штам цей був названий культурою BCG (Bacterium Calmett – Guerin), а по-українському – БЦЖ. Кальметт і Герен запропонували використовувати культуру БЦЖ як безпечну вакцину для імунізації людини і тварин, в першу чергу – ВРХ.

Необхідно також мати на увазі, що мікобактерії вакцинного штаму БЦЖ в організмі вакцинованих тварин піддаються L-трансформації.

Схема лабораторної діганостики туберкульозу

Фарбування за Цилем-

Нільсоном

Фазовоконтрастна

мікроскопія

Люмінісцентний

метод

Патологічний матеріал

(заглоткові, підщелепні, середостінні, портальні,

брижові, у тому числі ті, що знаходяться в області ілеоцикального з`єднання та порожьої кишки, надвим`яні, передлопаткові і колінної складки лімфатичні вузли, а також шматочки органів із

підозрюваними на туберкульоз змінами)