3.3. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам Цель занятия

Знакомство с методами определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Основные сведения

Природные и синтетические антимикробные препараты используют для лечения инфекционных заболеваний. Для обеспечения надежного антимикробного эффекта необходимо производить подбор препаратов, обладающих наибольшей активностью в отношении выделенной культуры микроорганизмов. С этой целью в процессе микробиологической диагностики выделенной чистой культуры возбудителя проводят качественную и количественную оценку чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом дисков (диффузионный тест)

Метод основан на подавлении роста микроорганизмов на плотной питательной среде под действием антимикробного препарата, нанесенного на бумажный диск (в продаже имеются готовые стандартные бумажные диски с широким ассортиментом современных препаратов в строго определенной концентрации, которую определяют исходя из терапевтических концентраций). В результате диффузии препарата в среду вокруг диска образуется градиент концентрации антибиотика – зона подавления роста микроорганизмов. Размер зоны подавления роста зависит от чувствительности бактерий и свойств препарата.

Для проведения исследования готовят взвесь, содержащую стандартное количество жизнеспособных клеток, которую засевают газоном на поверхность плотной питательной среды (Мюллер-Хинтон или агар АГВ, не препятствующий диффузии препаратов) в чашки Петри. Диски с препаратами накладывают на посев на расстоянии 2,5 см от центра чашки по кругу (на одну чашку не более 5 дисков). Посевы инкубируют 18–20 часов при 35ºС. При соблюдении методики на фоне равномерного бактериального газона вокруг дисков образуются зоны подавления роста круглой формы. Учет результатов осуществляют путем измерения диаметра зоны подавления роста. За зону, подлежащую измерению, принимают тот участок, на котором рост бактерий полностью отсутствует. Интерпретацию полученных результатов осуществляют на основании критериев, приведенных в Приложении 2.

Применение метода дисков имеет ряд ограничений. Метод пригоден только для определения чувствительности быстрорастущих бактерий, образующих в течение 24 часов гомогенный газон на стандартной плотной питательной среде достаточно простого состава (Мюллер-Хинтон или агар АГВ). В противном случае полученная информация будет недостоверной. Таким образом, метод дисков не может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам всех медленно растущих и большинства прихотливых бактерий, к числу которых относятся многие возбудители болезней человека (Mycobacterium spp., Helicobacter spp., Bacteroides spp. и многие другие). Метод дисков не дает надежных результатов также при определении чувствительности бактерий к препаратам, плохо диффундирующим в агар, например, полипептидным антибиотикам (полимиксин, ристомицин).

Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведений.

Данный метод применяют для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) – наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бактерий. Готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЕД/мл) в физиологическом или буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовления серийных (2-кратных) разведений антибиотика в питательной среде – бульоне (в объёме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плотности (чаще 10³–10⁵ м/о/мл) и засевают по 0,1–0,2 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37ºС 20–24 ч и более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подавляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.

Метод серийных разведений может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам любых микроорганизмов, включая прихотливых и медленно растущих, а также облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий, риккетсий и вирусов). В последнем случае антимикробные препараты в различных концентрациях добавляют в среду для культивирования клеток, после чего клетки заражают чистой культурой тестируемого вируса или бактерии. Результат оценивают по ЦПД или с помощью серологических реакций, позволяющих обнаружить накопление антигенов возбудителя в зараженных клетках. Чаще всего с этой целью применяют иммунофлюоресцентный метод (ИФ). Наименьшую концентрацию препарата, препятствующую развитию ЦПД или накоплению в клетках антигенов возбудителя, принимают за МПК.

Интерпретацию результатов, т.е. оценку клинической чувствительности, осуществляют на основании критериев, приведенных в Приложении 2.