- •50. Применение спектрофотометрии в точной колориметрии.
- •51. Спектрофлуориметрия. Природа флуоресцентных спектров. Особенности флуориметра.
- •52. Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией.
- •53. Применение спектрофлуориметрии. Качественный анализ и количественный.
- •54. Флуоресцентные методы анализа структуры белоксодержащих комплексов.
- •55. Инфракрасная спектроскопия. Особенности ик-спектрометра. Источники света и ик-спектроскопия. Монохроматоры и детекторы.
- •56. Качественный анализ: идентификация веществ и расшифровка структуры.
52. Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией.
Благодаря тому что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации вещества, во флуориметрах используется сравнительно простая электроника. Спектрофлуориметрические методы обладают высокой чувствительностью и позволяют работать с крайне малыми концентрациями вещества, когда спектры поглощения регистрировать очень трудно; по флуоресценции можно обнаружить, например, 0,01 мкг катехоламинов или НАД-Н. Чувствительность флуориметров легко менять в широком диапазоне, усиливая ток фотоумножителя. Спектрофлуориметры обладают хорошей спектральной селективностью, поскольку благодаря стоксо- вому сдвигу можно использовать два монохроматора — один настроенный на длину волны возбуждающего света, а другой — на длину волны флуоресценции. Во флуориметре не требуется кюветы сравнения, но надо иметь калибровочную кривую.
Основная трудность, возникающая при флуориметрическйх изменениях, — это тушение флуоресценции, когда энергия возбуждения молекул переходит не в световую, а в тепловую энергию их движения.
53. Применение спектрофлуориметрии. Качественный анализ и количественный.
Применение. Качественный анализ. Получение и сравнение спектров флуоресценции и возбуждение соединений позволяет идентифицировать и изучать эти соединения.
Количественный анализ. Флуориметрия широко применяется в биохимических исследованиях благодаря высокой точности, чувствительности и воспроизводимости, получаемых результатов. В качестве исследования витамина В1 в пищевых продуктах. В НАДН, митохондриях, микроорганизмах при различных метаболических условиях АТФ, хлорофила, кортикостироидов.
Практическое применение: хроматография, масс-спектрометрия, биотехнология, анализаторы углерода, спектроскопия, рентгеновское оборудование, испытательные машины УФ-ВИД спектрофотометры, спектрофлуориметр, ИК-Фурье спектрометры, ААС, эмиссионные спектрометры, пищевая промышленность, фармацевтическая промышленность, экология
54. Флуоресцентные методы анализа структуры белоксодержащих комплексов.
Белки взаимодействуют с такими природными соединениями как: углеводы, липиды, белки, нуклеиновые к-ты, синтетические полиэлектролиты и т.д. Образуют соответствующие комплексы или надмолекулярные ансамбли.
Метод флуоресцентной спектроскопии является одним из наиболее распространенных для изучения физико-химических свойств в биологических системах. Этот метод позволяет следить за изменениями в микроокружении собственных флуорофоров белка или введенной флуоресцентной метки.
Белки содержат 3 аминокислотных остатка, которые вносят в основной вклад в собственную флуоресценцию. Собственная флуоресценция большинства белков обусловлена в первую очередь трептофановыми остатками. Для селективного возбуждения остатков трептофана используют диапазон волны 295-305 нм в котором поглощения тирозина и фенилаланина минимально. Флуоресцентные свойства трептофана крайне чувствительны к изменению его микроокружения и главным образом полярности. Высокая чувствительность ( по белку 10-6- 10-7 моля) позволяет исследовать разбавленные растворы что важно при изучении структуры склонных к агрегации белков. Для повышения чувствительности метода при изучении структуры биологических объектов широко используются флуоресцентные метки (флуорофоры, ковалентно связанные с исследуемым биологическим обьектом) флуоресцентные зонты (флуорофоры, нековалентно связаны с биологическими обьектами ).