Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
50-56 методы.docx
Скачиваний:
19
Добавлен:
23.11.2019
Размер:
29.6 Кб
Скачать

52. Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией.

Благодаря тому что интенсивность флуоресценции пропорцио­нальна концентрации вещества, во флуориметрах используется сравнительно простая электроника. Спектрофлуориметрические ме­тоды обладают высокой чувствительностью и позволяют работать с крайне малыми концентрациями вещества, когда спектры погло­щения регистрировать очень трудно; по флуоресценции можно об­наружить, например, 0,01 мкг катехоламинов или НАД-Н. Чувст­вительность флуориметров легко менять в широком диапазоне, уси­ливая ток фотоумножителя. Спектрофлуориметры обладают хоро­шей спектральной селективностью, поскольку благодаря стоксо- вому сдвигу можно использовать два монохроматора — один на­строенный на длину волны возбуждающего света, а другой — на длину волны флуоресценции. Во флуориметре не требуется кюве­ты сравнения, но надо иметь калибровочную кривую.

Основная трудность, возникающая при флуориметрическйх изменениях, — это тушение флуоресценции, когда энергия воз­буждения молекул переходит не в световую, а в тепловую энергию их движения.

53. Применение спектрофлуориметрии. Качественный анализ и количественный.

Применение. Качественный анализ. Получение и сравнение спектров флуоресценции и возбуждение соединений позволяет идентифицировать и изучать эти соединения.

Количественный анализ. Флуориметрия широко применяется в биохимических исследованиях благодаря высокой точности, чувствительности и воспроизводимости, получаемых результатов. В качестве исследования витамина В1 в пищевых продуктах. В НАДН, митохондриях, микроорганизмах при различных метаболических условиях АТФ, хлорофила, кортикостироидов.

Практическое применение: хроматография, масс-спектрометрия, биотехнология, анализаторы углерода, спектроскопия, рентгеновское оборудование, испытательные машины УФ-ВИД спектрофотометры, спектрофлуориметр, ИК-Фурье спектрометры, ААС, эмиссионные спектрометры, пищевая промышленность, фармацевтическая промышленность, экология

54. Флуоресцентные методы анализа структуры белоксодержащих комплексов.

Белки взаимодействуют с такими природными соединениями как: углеводы, липиды, белки, нуклеиновые к-ты, синтетические полиэлектролиты и т.д. Образуют соответствующие комплексы или надмолекулярные ансамбли.

Метод флуоресцентной спектроскопии является одним из наиболее распространенных для изучения физико-химических свойств в биологических системах. Этот метод позволяет следить за изменениями в микроокружении собственных флуорофоров белка или введенной флуоресцентной метки.

Белки содержат 3 аминокислотных остатка, которые вносят в основной вклад в собственную флуоресценцию. Собственная флуоресценция большинства белков обусловлена в первую очередь трептофановыми остатками. Для селективного возбуждения остатков трептофана используют диапазон волны 295-305 нм в котором поглощения тирозина и фенилаланина минимально. Флуоресцентные свойства трептофана крайне чувствительны к изменению его микроокружения и главным образом полярности. Высокая чувствительность ( по белку 10-6- 10-7 моля) позволяет исследовать разбавленные растворы что важно при изучении структуры склонных к агрегации белков. Для повышения чувствительности метода при изучении структуры биологических объектов широко используются флуоресцентные метки (флуорофоры, ковалентно связанные с исследуемым биологическим обьектом) флуоресцентные зонты (флуорофоры, нековалентно связаны с биологическими обьектами ).