3. Открытие действия сахаразы.

Принцип метода. Сахараза катализирует действие сахарозы до глюкозы и фруктозы.

С ₁₂Н₂₂О₁₁ + Н₂О 2С₆Н₁₂О₆

Реактивы и оборудование:

• препарат сахаразы;

• 0,2% - ный раствор сахарозы;

• реактив Фелинга.

Ход работы:

В 2 пробирки наливают по 1 мл препарата фермента. Содержимое одной из пробирок (контроль) кипятят в течении 3 мин для разрушения сахаразы , после чего добавляют по 3 мл раствора сахарозы, хорошо перемешивают и термостатируют при t = 38⁰C. Через 15 мин в обе пробирки вносят по 2 мл реактива Фелинга, перемешивают, нагревают до кипения. В контрольной пробирке осадка нет, а в пробирке с активным ферментом образуется красный осадок гемиоксида меди.

4. Открытие действия пероксидазы.

Принцип метода. Пероксидаза ускоряет реакцию окисления органических веществ под влиянием пероксида водорода.

Реактивы и оборудование:

• экстракт хрена водный;

• гваяколовая смола;

• 0,5 % - ный раствор пероксида водорода.

Ход работы:

К 1 мл экстракта хрена добавляют 1 – 2 капли свежеприготовленного 5% - ного раствора гваяколовой смолы. При добавлении к смеси 1 – 2 капель 0,5% - ного раствора пероксида водорода появляется ярко – синее окрашивание.

2. Определение активности ферментов.

1. Определение активности амилазы слюны по методу Вольгемунта.

Принцип метода. Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мо 0,1% - ного раствора крахмала. Амилазная активность слюны выражается количеством миллилитров 0,1% - ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл неразбавленной слюны при температуре 38⁰С в течение 30 мин.

Реактивы и оборудование:

• 0,1% - ный раствор крахмала;

• 0,1% - ный раствор иода;

• раствор слюны;

• лед.

Ход работы:

В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз слюны, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают, 1 мл смеси переносит в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержимое фермента в 2 раза меньше, чем впредыдущей и разведение слюны в десяти пробирках составляет: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, 1:5120, 1: 10240.

Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают термостатировать при t = 38⁰C на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по 2 капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет.

Отметив, при каком разведении, произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной слюны (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность слюны (А мл слюны расщепляет х мл 0,1% - ного раствора крахмала). Например, желтоватый цвет появился в 4 – й пробирке, где слюна разведена в 160 раз. Это количество слюны способно гидролизовать 2 мл 0,1% - ного раствора крахмала, а 1 мл неразбавленной слюны в тех же условияхгидрализует 320 мл: х = 2 _* 160/1. Следовательно, амилазная активность слюны равна 320.