Глава 4. Резистентность (устойчивость) паразитов к антипаразитарным препаратам и пути ее преодоления а.А.Черепанов

Всероссийский институт гельминтологии имени К.И.Скрябина

Доказано, что применение одних и тех же препаратов обусловливает появление резистентности (устойчивости) к ним микроорганизмов, паразитов и насекомых. Прошло более 40 лет с момента выявления у гемонхусов устойчивости к фенотиазину. За этот период были разработаны другие препараты, в том числе из группы бензимидазолов, авермектинов и мильбемицинов. Однако в результате их масштабного и постоянного применения также отмечают случаи резистентности паразитов.

В печати появилось немало сообщений на указанную тему, где говорится, что ее решение во многом определяет рациональность и экономическую сторону использования лечебных препаратов. Через три года после открытия тиобендазола - антгельминтика широкого спектра действия - были зарегистрированы резистентные к нему штаммы стронгилят пищеварительного тракта. В некоторых странах вспышки кокцидиоза птиц проходили на фоне постоянного применения сульфаниламидов.

Таким образом, накопились данные о многократной резистентности паразитов (гельминтов и простейших) к разным классам химических соединений.

Цель нашей работы - изучить антгельминтную резистентность паразитов в зависимости от вида их дефинитивных хозяев.

Овцы. В одном из штатов Австралии - зоны интенсивного овцеводства - в 1968 году установлены резистентные к тиабедазолу штаммы гемонхусов. Через девять лет аналогичные результаты отмечены уже на 55% ферм от их общего числа. После того как препарат заменили на другой из того же класса бензимидазолов, оказалось, что штаммы гемонхусов, остертагий, трихостронгилов, нематодирусов обладают побочной устойчивостью к пар-, окс-, кам-, фен-, албендазолам и перекрестной к левамизолу, морантелу, нафтолфосу. Для подтверждения этого использовали специальные тесты. Все препараты в рекомендованных дозах были низкоэффективными.

В Южной Африке обнаружены устойчивые штаммы гемонхусов, остертагий, трихостронгилид, обладающие побочной резистентностью к препаратам бензимидазольного ряда и перекрестной к клозантелу, рафоксаниду, ивермектину в терапевтических дозах (S.Berger, 1975). На фермах США выделены штаммы гемонхусов, остертагий, трихостронгилид, имеющие перекрестную устойчивость к тиабендазолу, фенбендазолу, камбендазолу и ивермектину соответственно в дозах 66, 15, 20 и 0,25 мг/кг массы тела. Эффективность последнего к стронгилятам составляла 60% (D.J.Giordano et al., 1987). Подобные штаммы, резистентные к левамизолу, зарегистрированы в Бразилии, Великобритании и странах Европы. В Нидерландах первое сообщение об устойчивых к тиабендазолу штаммах гемонхусов появилось в 1982 году. На 10 фермах, расположенных на территории Германии, установлены Р-штаммы (резистентные) гемонхусов, трихостронгилид к препаратам из группы бензимидазолов.

Крупный рогатый скот. E.T.Lyons et al. (1981) отмечали, что эффективность левамизола при длительном назначении телятам против остертагий снижается. Выявлены также левамизол-резистентные штаммы остертагий. Оксфендазол в терапевтической дозе неэффективен при трихостронгилидозах, а морантел - при остертагиозах у телят. В Бельгии с помощью специального теста обнаружен Р-штамм остертагиц к левамизолу и перекрестно резистентный к фенбендазолу, морантелу и тиабендазолу.

Лошади. На 34 фермах Австралии большинство животных было инвазировано бензимидазол-резистентными штаммами стронгилид и циатостом. И зависело это от частоты их дегельминтизаций. Аналогичные факты установлены в США и Великобритании (M.C.Round et al., 1974). Выявлены Р-штаммы циатостом животных к бензимидазолам (D.Ullrich, 1987).

Свиньи. В Дании обнаружены Р-штаммы эзофагостом к пирантелу, обладающие перекрестной резистентностью к левамизолу.

Птицы. В результате многократного применения аскаридии стали устойчивыми к пиперазину и нилверму, а кокцидии - к сульфадиметоксину и сульфомонометоксину.

Пути преодоления резистентности паразитов к лечебным средствам заключаются, во-первых, в замене препаратов одной химической группы на другую или чередовании. В тех случаях, когда это сделать невозможно, определяют их общую терапевтическую эффективность против тех или ииных видов.

Показатели значительного снижения эффективности препаратов в рекомендованных дозах по сравнению с данными за предыдущие периоды (годы) ориентируют специалистов на вероятность появления Р-штаммов. При изменении (увеличении) дозы повышается устойчивость отдельной части паразитов, и тогда на общем фоне повышения эффективности препаратов в организме животных остаются наиболее резистентные штаммы. Последние могут быть источником следующих генераций.

Для повышения эффективности препаратов и снижения уровня резистентности к ним паразитов используют смеси. Так, при кокцидиозе птиц рекомендуют назначать сульфаниламиды в сочетании с антифолиевой кислотой или полиэфирные антибиотики со специальным салимицином и другими средствами.

Для управления факторами паразитарной резистентности (ПР) необходимо знание основ теории самого процесса, которое позволит определять скорость ее развития для разных видов паразитов под влиянием различных препаратов и рационального применения их в оптимальных дозах.

В связи с этим остановимся на некоторых теоретических аспектах проблемы, касающихся видов, механизма, уровня и методов оценки резистентности.

Лекарственная резистентность - это способность отдельных особей в штамме переносить дозы препарата, которые являются летальными для большинства из них в нормальной популяции того же вида. Различают побочную и перекрестную. Первая представляет собой резистентность к нескольким препаратам аналогичной химической группы (структуры) и механизма действия; вторая - близкая к ней, но включает препараты с разной химической структурой и механизмом действия. Принято новое понятие "реверсия" - возврат к чувствительности у первоначально резистентного штамма после прекращения воздействия на него лекарственного вещества.

Термин "штамм" применительно к паразитам (гельминтам и простейшим) в нашем понимании - это совокупность особей определенного вида, паразитирующих у животных (птиц) в конкретной географической зоне и специфически реагирующих (чувствительность, резистентность) на действие препаратов определенного класса химических соединений.

Механизм резистентности. У гельминтов она возникает при длительном применении лечебных препаратов (3-5 лет и более) со сходной химической формулой, структурой и одного механизма действия. В основе появления устойчивости у отдельных штаммов паразитов лежит генетический механизм селекции. До использования препарата с новой химической структурой в популяции уже присутствуют особи, имеющие к нему гены резистентности, но в малом количестве по сравнению с чувствительными особями. Систематическое действие химических соединений приводит к их селекции. ВА результате чувствительные особи погибают, а резистентные, выжившие после лечения, остаются. Последние имеют гены, которые они передают следующему поколению. Скорость развития резистентности зависит от генетической вариации в популяции и кратности применения препаратов.

При комплексном изменении различных генов (мутации) возникает перекрестная резистентность к различным классам препаратов. Установлено, что резистентные штаммы гельминтов по сранению с чувствительными более плодовиты и проявляют повышенную степень закрепления в организме хозяина. Поэтому интенсивность инвазирования пастбищ яйцами и личинками гельминтов у первого штамма выше, чем у второго.

Механизм резистентности зависит от фармакокинетики терапевтических средств. Например, по отоношению к левамизолу и морантелу она предполагает изменение или потерю ацетилхолиновых рецепторов, а по отношению к другим антгельминтным препаратам этого класса - снижение степени связывания тубулина микротубул кишечного эпителия нематод с бензимидазолами. Однако возможны и другие механизмы развития резистентности.

Ряд зарубежных ученых предполагают, что развитие резистентности у гельминтов связано с изменениями в их энергетическом обмене. У резистентных штаммов анаэробная стадия обмена углеводов может переключаться на аэробную. Это снижает их зависимость от фумаратредуктазного пути углеводного обмена, который чувствителен к бензимидазолам. Для более эффективного действия некоторых групп антгельминтиков широкого спектра действия повышают резистентность, которую контролируют чувствительными анализами ДНК. С помощью последних определяют частоту появления резистентных аллелей (расщепленных генов), пока она еще относительно низкая.

Некоторые авторы считают, что резистентные штаммы гельминтов по сравнению с чувствительными более экономно расходуют резервный гликоген. Кроме того, Р-штаммы способны вступать в состояние гипобиоза. Причиной этого является эндокринный сдвиг в организме хозяина, а также приобретенный иммунитет при повышении неспецифической резистентности под воздействием низких доз препаратов.

Методы выявления резистентности. Прежде всего они необходимы для коррекции практического применения препаратов с одинаковой химической структурой в условиях их частого использования. В Австралии при развитии Р-штаммов стронгилят пищеварительного тракта овец к тиабендазолу и левамизолу экономический ущерб оценивали 4-6 млн долл. США в год.

В отечественной ветеринарии первые самостоятельные исследования, касающиеся апробирования тестов резистентности паразитов к антипаразитарным средствам, и в частности, на примере стронгилят пищеварительного тракта жвачных, проведены в конце 80х годов. Исследования завершены разработкой первых в этом плане "Методических рекомендаций по выявлению антгельминтной резистентности у стронгилят пищеварительного тракта жвачных" (А.А.Черепанов, Р.С.Кармалиев, 1991).

Для тестирования антгельминтной резистентности применяют in vivo методы. К первому относят критический и контрольный тесты, ко второму - биологические (вылупление, развитие личинок до инвазионной и половозрелой стадий, паралич личинок с использованием микроизмерителя подвижности и эзерина) и биохимические (тубулинсвязывающий, уровень активности фумаратредуктазы, неспецифических эстераз, ацетилхолинэстеразы и малик-энзима) тесты.

С помощью in vivo тестов определяют резистентность гельминтов к препаратам разных химических соединений, а in vitro - к бензимидазолу, некоторым авермиктинам и другим препарартам.

Технически наиболее просто выполнить тест вылупления личинокиз яиц гельминтов. Яйца гельминтов, в частности нематод, культивируют в растворах препаратов разной концентрации при температуре 27с в течение 24 ч (для стронгилят). Выходят личинки из яиц резистентного штамма по сравнению с чувствительными при их повышенных дозах. Коонцентрация препарата, при которой погибает 50% яиц (ЛК₅₀), является количественным показателем чувствительности данного штамма. Величину резистентности - фактор (ФР) определяют соотношением ЛК₅₀ резистентного штамма и тестируемого. Если ФР больше единицы, то тестируемый штамм устойчив к препарату, если равен - чувствителен.

Для того чтобы данные были точными, необходимо брать культуру яиц на начальной стадии эмбриогенеза, так как препараты из группы бензимидазолов ингибируют развитие зародыша на ранней стадии и далее он менее чувствителен к ним.

Из in vitro тестов следует отметить тубулинсвязывающий. Тубулин - белковый компонент цитоплазматических микротубул. Основан он на том, что, к примеру, бензимидазолы, связывась с тубулином, ингибируют полимеризацию микроканальцев нематод. Используя это свойство, меченные тритием бензимидазолы связываются с тубулином нематод. Р-Штаммы, свободные от антгельминтика, связывают меньшее количество препарата, чем чувствительные.

Согласно последним данным среди доступных тестов резистентности гельминтов особое значение придают молекулярным анализам бензимидазол-резистенции (BZ-R) по показателям -тубулина BZ-чувствительных (BZ-S) и BZ-резистентных популяций, в частности гемонхусов и трихостронгилид. При сравнении последовательности ДНК между генами изотипа 1 BZ-R- и BZ-S-популяций было выявлено несколько аллелей. Различались они по локализации, последовательности и внутреннему строению. Мутация возникала только в генетических клетках аминокислоты (аминокислота 200). По изменению кодированных аллелей в 200 точках установлена их общая связь с резистенцией в анализируемых популяциях. Резистентная мутация обязательна при селекции и меньше проявляется у Р-штаммов, чем у чувствительных. В стадии разработки находится чувствительная реакция РСК, которая позволит, по-видимому, детально изучить генетику популяуций BZ-R и BZ-S нематод.

Для паразитологического контроля необходимо разработать новые методы, в том числе на основе моделирования. Простые модели ПР гастроинтестинальных нематод позволили бы выделить факторы, влияющие на резистентность и управлять вопросом дозирования препаратов.

Важное значение имеют биохимические методы выявления резистентности. В частности, антгельминтное действие препаратов объясняют ингибированием ферментов эндопаразитов (R.K.Prichard, 1973). У большинства гельминтов, обитающих в среде с пониженным содержанием кислорода (в пищеварительном канале), основными ферментами энергетического метаболизма являются фумаратредуктаза и малик-энзим. Они специфически уязвимы при воздействии препаратов. Отсюда и дифференциация на резистентные и чувствительные штаммы паразитов.

Высокую активность неспецифических эстераз у резистентных штаммов предложено устанавливать по интенсивности окраски продуктов реакции в пробах из личинок. Для более точного определения применяют изоэлектическое фокусирование гомогенатов из инвазионных личинок нематод. Появление полосы активности фермента на электрофореграмме неспецифических эстераз указывает на резистентность штамма (I.A.Sathemland et al., 1988). У Р-штаммов стронгилят активность фермента ацетилхолиностеразы выше, чем у чувствительных.

Мы считаем, что показатели активности, или ингибирования, ферментов фумаратредуктазы и малин-энзима у гельминтов являются также тестами их резистентности.

В Японии модели резистенции к кокцидиостатикам получены путем выделения изолятов из полевых штаммов кокцидий и пассажа на лабораторных моделях (курах) в нескольких генерациях под воздействием небольших доз робендина или сульфадиметоксина. Измененный штамм вида Eimeria acervulina приобретал искусственную резистентность к сульфадиметоксину и стал чувствительным к нему только после следующих 15 генераций, когда препарат не применяли. Однако единичные ооцисты, выделенные из нескольких видов, сохраняли эту устойчивость. Следовательно, смешанные виды кокцидий восстанавливают чувствительность к препаратам, а резистентный не изменяет своих приобретенных качеств длительное время.

Заключение. При длительном применении антипаразитарных средств одной химической структуры образуются Р-штаммы паразитов. Имеющиеся научные разработки в данном направлении обеспечивают подходы к практическому решению проблемы и стратегию преодоления резистентности паразитов к препаратам. Вместе с тем для более глубокого изучения вопроса необходимо продолжать исследования.