МДФд_23

МДФд-23В. Теоретический материал

МИКОБАКТЕРИИ

Микобактерии относятся к порядку Actinomycetales, где в рамках семейства

Mycobacteriaceae формируют род Mycobacterium.

Культивируемые на искусственных питательных средах микобактерии делятся на две основные подгруппы: быстрорастущие (формирующие видимый рост за неделю) и медленнорастущие (которым для формирования видимого роста нужно времени больше, чем неделя). По способности образовывать пигмент быстрорастущие микобактерии делятся на нехромогенные, лишенные такой способности (например, M.smegmatis), и обладающие способностью к пигментообразованию (например, M.phlei). Медленнорастущие микобактерии также делятся на нехромогенные (например, комплекс M.avium-intracellulare) и хромогенные (например, M.kansasii). Все они определяются как условно-патогенные, или атипичные, микобактерии. К патогенным микобактериям относится третья подгруппа медленнорастущих микобактерий, в которую выделены возбудители туберкулеза, а также отдельная (наравне с культивируемыми микобактериями) группа – некультивируемые микобактерии, включающая в себя единственный вид: M.leprae.

Микобактерии – особая группа прокариот, отличающаяся от остальных бактерий своей ки- слото-, спирто- и щелочеустойчивостью, высоким содержанием липидов в клеточной стенке (более половины еѐ массы), очень медленных ростом.

Высокое содержание липидов в клеточной стенке обусловливает окрашивание микобактерий по Цилю-Нильсену в красный цвет. Вместе с тем необходимо иметь в виду, что встречаются и кислотоподатливые (окрашивающиеся по Цилю-Нильсену в синий цвет) микобактерии.

ВОЗБУДИТЕЛИ ТУБЕРУЛЕЗА

Возбудителями туберкулеза являются три вида: M.tuberculosis (вызывает примерно 92% случаев туберкулеза у человека), M.bovis (этиологический фактор примерно 5% случаев туберкулеза у человека) и M.africanum (на который приходится отсавшиеся 3% случаев туберкулеза в человеческой популяции).

«Палочка Коха» (собирательный термин, часто используемый для обозначения возбудителя туберкулеза) – это тонкая и стройная, похожая на швейную иглу, прямая или слегка изогнутая палочка, обладающая большим полиморфизмом (в том числе и по своим тинкториальным свойствам), особенно – в организме больных под влиянием лечебных препаратов.

Палочка Коха имеет сложные питательные потребности. На жидких средах вырастает за неделю в виде морщинистой пленки, на плотных – в течение 2-4 недель, формируя R-формы колоний (похожие на бородавки или цветную капусту) с желтым пигментом. Лучшей средой для ее выделения считается свернутая среда Левенштейна-Иенсена в разных модификациях (включает в себя малахитовый зеленый как агент, ингибирующий рост контаминирующей патологический материал сопутствующей микрофлоры).

Единственный тест, используемый для идентификации возбудителей туберкулеза и основанный на их биохимических свойствах – ниациновая проба (о ней будет сказано ниже).

Антигенами палочки Коха являются туберкулопротеин, полисахариды, фосфатиды, кордфактор. Но антигенный состав всех видов микобактерий сходен, вследствие чего серологический метод их идентификации практически не используется.

К факторам патогенности палочки Коха относятся сульфатиды (серосодержащие гликопротеиды), корд-фактор (гликолипид, располагающийся на поверхности и в толще клеточной стенки), липиды и белки.

Сульфатиды снижают активность фагоцитов, ингибируя в них фагосомо-лизосомальное слияние, а также усиливают действие корд-фактора.

Корд-фактор – главный фактор патогенности возбудителей туберкулеза, лишенные его туберкулезные палочки являются невирулентными или слабовирулентными для человека. Кордфактор поражает мембраны митохондрий, блокируя в них процессы окислительногофосфорилирования. Кроме того, он тормозит миграцию фагоцитов.

Липиды туберкулезной палочки оказывают повреждающее действие на ткани макроорга-

низма.

Токсические липиды палочки Коха состоят из нейтральных жиров, восков, стеринов, фосфатидов, жирных кислот (фтиоидной, миколовой, туберкулостеариновой, пальмитиновой), кордфактора.

Выделяют три фракции токсических липидов туберкулезной палочки. Наиболее активная из них – фосфатидная фракция (содержит фтиоидную кислоту), которая вызывает специфическую тканевую реакцию с образованием эпителиоидных клеток. Жировая (нейтральные жиры) фракция, также содержащая фтиоидную кислоту, вызывает образование туберкулоидной ткани. Восковая фракция (содержит миколовую кислоту) вызывает реакции с образованием многочисленных гигантских клеток.

Белки палочки Коха (составляют основу туберкулина) вызывают сенсибилизацию организма, но, наряду с этим, оказывают еще и повреждающее действие на ткани.

Возбудители туберкулеза устойчивы во внешней среде. При кипячении погибают через 5 минут, прямой солнечный свет убивает их в течение часа. Химические дезинфектанты по отношению к микобактериям малоэффективны (например, 5% раствор фенола убивает их только через 5- 6 часов). Туберкулезная палочка способна вырабатывать устойчивость ко многим антибактериальным средствам.

ТУБЕРКУЛЕЗ

Источником инфекции при туберкулезе является больной человек, реже – животное. Основной механизм передачи аэрозольный (чаще – воздушно-пылевой). Дополнительный путем заражения служит алиментарный, в частности, заражение M.bovis часто происходит от крупного рогатого скота через молоко и молочные продукты.

Туберкулез – это инфекционное заболевание человека и животных, характеризующееся наклонностью к хроническому течению и образованием специфических воспалительных изменений (туберкулом). Туберкулезная палочка может поражать любой орган и любую ткань.

Входными воротами инфекции служат дыхательные пути (чаще всего), любые слизистые оболочки и любой поврежденный участок кожи. Из ворот инфекции фагоцитами туберкулезные палочки доставляются в региональные лимфатические узлы. При этом у инфицированного чело-

века формируется так называемый первичный туберкулезный комплекс: гранулема в месте внедрения возбудителя + воспалительный процесс в региональных лимфатических узлах + сенсибилизация организма. При доброкачественном течении гранулема кальцифицируется и рубцуется, а

учеловека формируется противотуберкулезный иммунитет (но возбудитель в гранулеме сохраняется). При действии неблагоприятных факторов, снижающих антиинфекционную резистентность организма человека, происходит гематогенная генерализация процесса с образованием множественных очагов, склонных к распаду.

Инфекционная гранулема (бугорок) при туберкулезеобразуется в месте внедрения возбудителя и является следствием защитной реакции организма, направленной на локализацию возбудителя в месте внедрения.

Вцентре ее находятся гигантские клетки Пирогова-Лангганса с множеством ядер, именно в этих клетках и находятся туберкулезные палочки. Центр гранулемы окружен эпителиоидными клетками, составляющими главную ее массу. По периферии располагаются лимфоидные клетки.

При неблагоприятном течении процесса инфекционная гранулема может увеличиваться и подвергаться творожистому (казеозному) распаду под влиянием токсических продуктов туберкулезной палочки.

При благоприятном течении процесса инфекционная гранулема окружается соединительнотканной капсулой, сморщивается и пропитывается солями кальция. Так как туберкулезная палочка в ней сохраняется, туберкулез является примером заболевания, при котором вырабатывается так называемый нестерильный иммунитет.

Ведущую роль в иммунитете при туберкулезе играют Т-клетки. Антитела к корд-фактору и другим факторам вирулентности палочки Коха играют вспомогательную роль. Локализация возбудителя путем образования гранулем происходит вследствие реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), очень выраженной при этой инфекции.

Инфекционная аллергия всегда сопутствует инфицированию туберкулезной палочкой. Выявляется туберкулиновыми пробами (в большинстве стран предпочтение отдается внутрикожному тесту – реакции Манту). Реакция Манту становится положительной через 6-10 недель после инфицирования. Туберкулин, используемый в качестве аллергена, представляет собой фильтрат автоклавированной бульонной кльтурыM.tuberculosis. Для реакции Манту используется очищенный белковый препарат туберкулина (ППД).

У детей туберкулиновая проба может иметь диагностическую ценность (а именно, у детей, не вакцинированных БЦЖ). У взрослых туберкулиновые пробы ставятся с целью определения инфицированности, отбора контингента для ревакцинации, контроля эффективности вакцинации, а также для оценки течения туберкулезного процесса.

Сенсибилизированный организм (т.е. инфицированный туберкулезной палочкой) приобретает способность быстро связывать новую дозу возбудителя и удалять ее (в этом процессе ведущую роль играют Т-лимфоциты) из организма. Поэтому заболевание туберкулезом у взрослых, уже инфицированных туберкулезной палочкой, в большинстве случаев протекают относительно доброкачественно, в виде местного процесса в легких, а не в виде генерализованного процесса, как

удетей при первичном заражении.

Патологическим материал при микробиологической диагностике туберкулеза забирается из пораженного органа (при туберкулезе легких, наиболее часто встречающейся форме этой инфекции, берется мокрота). Патологический материал микроскопируется (используется окраска по Ци- лю-Нильсену и окраска флуорисцентным красителем аурамином) и, после обработки (для избавления от сопутствующей микрофлоры) кислотой и последующей нейтрализацией щелочью используется для выделения чистой культуры и для заражения морской свинки. Выделенная чистая культура идентифицируется до вида и тестируется на предмет чувствительности к лечебным препаратам. Морская свинка в положительном случае заболевает и погибает. Наличие в патологическом материале возбудителей туберкулеза можно выявить и с помощью ПЦР.

Таким образом, при микробиологической диагностике туберкулеза используются микроскопический, культуральный, биологический, молекулярно-генетический методы. Серологический метод (выявление в сыворотке крови специфических антител) используется редко.

Туберкулез – одна из немногих инфекций, диагноз которой можно поставить, используя микроскопический метод. Однако, концентрация туберкулезных палочек в патологическом материале невелика, поэтому прямая микроскопия может дать ложноотрицательный результат. Предпочтительней пользоваться методами обогащения (гомогенизацией, флотацией) – для повышения концентрации в полях зрения туберкулезных палочек. Еще более эффективна флуоресцентная микроскопия с обработкой мазка флуоресцентной краской, чаще всего – аурамином.

Метод гомогенизации заключается в том, что суточная доза мокроты разбавляется равным объемом 1% раствора едкого натра, энергично встряхивается 10-15 минут, нейтрализуется кислотой, центрифугируется и осадок используется для приготовления мазка. Метод флотации служит для еще более сильного обогащения микроскопируемого материала: гомогенизированная мокрота прогревается на водяной бане при 550С в течение 30 минут, после чего к ней добавляют 1-2 мл

ксилола, 10 минут встряхивают и отстаивают при комнатной температуре 20 минут – мазок делается из формируемого в результате отстаивания пенообразного слоя. Во всех случаях при микроскопической диагностике туберкулеза готовят так называемый «толстый мазок»: мокроту наносят на предметное стекло в несколько слоев, каждый раз дожидаясь, пока предыдущий слой подсохнет.

При использовании в диагностике туберкулеза культурального, а также биологического методов диагностики, патологический материал предварительно (т.е. перед засевом на питательную среду или перед введением лабораторному животному) обрабатывают кислотой, затем нейтрализуют щелочью и тщательно промывают водой. Эта процедура позволяет избавиться от посторонней, кислотоподатливой, микрофлоры, но замедляют и без того отнюдь не быстрый рост возбудителей туберкулеза, поэтому не применяется в тех случаях, когда патологический материал берется из закрытых полостей (т.е. он в норме должен быть стерилен).

При культуральном методе диагностики туберкулеза патологический материал засевается на среду Левенштейна-Йенсена и культивируется на протяжении от 2 до 12 недель. Выросшая культура идентифицируется с помощью ниациновой пробы (с этой целью может использоваться и биопроба). Обязательно определяют чувствительность выделенной культуры к туберкулостатическим препаратам.

При биологическом методе диагностики туберкулеза 0,1 мл патологического материала вводится морской свинке или подкожно в паховую область или внутрибрюшинно. На 5-10 сутки у животного развивается лимфаденит, а через 3-4 недели – положительная реакция на туберкулин. Погибает морская свинка через 1-2 месяца после начала эксперимента. Бывший раньше «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза, биологический метод в настоящее время менее информативен, поскольку изониазидустойчивые штаммы туберкулезной палочки снижают свою вирулентность для морской свинки.

Существует ускоренный метод выделения туберкулезной палочки (метод микрокультур, метод Прайса), осуществляемый следующим образом. Готовятся «толстые мазки» из патологического материала на узких предметных стеклах. Мазки обрабатываются 6% серной кислотой, нейтрализуются щелочным раствором, промываются водой. Затем помещают во флаконы с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4 (средой Школьникова). Через несколько дней культивирования (обычно каждый два дня по одному стеклу) мазки достают, окрашивают по ЦилюНильсену и микроскопируют. Этот метод позволяет не только выявить в мокроте микобактерии, но и определить их вирулентность: вирулентные располагаются в виде «лисьих хвостов» (вследствие наличия в них корд-фактора), невирулентные микобактерии располагаются беспорядочно.

Выделенная культура туберкулезной палочки идентифицируется до вида. Как правило, M.africanum в европейских лабораториях не идентифицируется, для отличия же M.tuberculosis (человеческого типа возбудителя туберкулеза) от M.bovis (бычьего типа возбудителя туберкулеза) используют ниациновую пробу Конно и биопробу. Нациновая проба осуществляется следующим образом: к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляется 1 мл раствора KCN и 1 мл раствора хлорамина, появляющаяся через несколько минут ярко-желтая окраска свидетельствует о том, что культура принадлежит к M.tuberculosis, если цвет не меняется – культура принадлежит M.bovis. Для дифференциации этих двух видов с помощью биопробы культурой (или, для экономии времени, мокротой больного) заражают одновременно морскую свинку и кролика. Морская свинка заболеет в любом случае – она служит индикатором наличия в патологическом материале туберкулезной палочки любого вида, а кролик заболеет лишь в случае заражения его

M.bovis.

Отдельную проблему представляет собой выявление L-форм туберкулезной палочки. Для этого используют три подхода. Во-первых, существуют специальные флюоресцирующие диагностические сыворотки против специфических антигенов L-форм палочки Коха (т.е. их можно выявить с помощью РИФ). Во-вторых, проводят засев патологического материала в специальную полужидкую среду с последующей микроскопией образовавшегося через полтора-два месяца мутного облачка с включениями (похожего на манную крупу) с помощью фазово-контрастного микроскопа; полученная культура может верифицироваться методом ПЦР. В третьих, используют многократные пассажи на морских свинках: при этом L-формы повышают свою вирулентность и, в конце концов, вызывают у лабораторного животного инфекцию.

Для специфической профилактики туберкулеза используется вакцина БЦЖ (вводится внутрикожно) – живой ослабленный штамм, полученный Кальметтом и Гереном из M.bovis. Эта вакцина в нашей стране входит в календарь обязательных прививок. Ревакцинацию проводят лицам с отрицательной туберкулиновой пробой. У новорожденных со сниженной резистентностью применяют менее реактогенную вакцину BCG-M (с меньшим содержанием антигена).

Для этиотропной терапии используют так называемые туберкулостатические препараты, которые классифицируются на препараты первого ряда (например, изониазид) и альтернативные средства (например, ПАСК – парааминосалициловая кислота). Курс лечения не должен продолжаться менее года.