Мед энзимология

где AM – амилаза мочи; АС – амилаза сыворотки; КРМ – креатинин в моче; КРС – креатинин в сыворотке.

В норме амилазо-креатининовый индекс не выше 3; превышение считается признаком панкреатита, т. к. при панкреатите возрастает уровень истинно панкреатической амилазы, и ее клиренс осуществляется на 80 % быстрее клиренса амилазы слюны. Однако установлено, что при остром панкреатите значительно увеличивается клиренс Р- и S-амилазы, что объясняется следующим образом. У здоровых людей амилаза сыворотки вначале фильтруется в почечных клубочках, а затем реабсорбируется канальцевым эпителием. При остром панкреатите механизм канальцевои реабсорбции подавляется вследствие избыточной экскреции Р- и S-амилазы. Поскольку амилазная активность сыворотки при остром панкреатите обусловлена в основном Р-амилазой, то при повышении клиренса общей амилазы повышается клиренс Р-амилазы. При остром панкреатите уровень амилазы сыворотки и показатель амилазо-креатининового клиренса обычно повышены за счет подавления почечного механизма канальцевой реабсорбции амилазы. При заболеваниях, протекающих под маской панкреатита, содержание амилазы сыворотки может увеличиваться, но показатель амилазо-креатининового клиренса остается нормальным, т. к. отсутствует канальцевый дефект. Очень важно для этого исследования брать кровь и мочу в одно и то же время.

При хроническом панкреатите активность амилазы в крови и моче повышается (у 10–88 % и у 21–70 % больных соответственно) в период обострения процесса и при возникновении препятствий к оттоку панкреатического сока (воспаление, отек головки поджелудочной железы и сдавление протоков, рубцовый стеноз сосочка двенадцатиперстной кишки и др.). При склеротической форме панкреатита гиперамилаземия определяется также степенью нарушения проходимости протоков и функциональной способностью оставшейся части железы. Для повышения чувствительности исследования активности амилазы крови и мочи при хроническом панкреатите А.И. Хазанов (1997) рекомендует проводить их анализ в первые сутки пребывания в стационаре, затем не менее 2 раз после инструментальных исследований (фиброгастродуоденоскопия, рентгенологическое исследование желудка и кишечника и др.), а также в момент усиления болей в животе. При этом чувствительность теста повышается от 40 до 75–85 %.

При хронических панкреатитах с фиброзными изменениями поджелудочной железы обострения, нередко выраженные и распространенные, сопровождаются сравнительно небольшим подъемом активности амилазы.

Вследствие нарушения функциональной способности поджелудочной железы гиперамилаземия нередко может отсутствовать при остром гнойном панкреатите (при обширных «тотальных» некрозах поджелудочной железы). При раке поджелудочной железы иногда повышается уровень амилазы в крови и моче; в других случаях их активность в пределах нормы или даже снижена.

21

Оценка результатов исследования активности амилазы в крови и моче затруднена тем, что фермент содержится в слюнных железах, толстой кишке, скелетных мышцах, почках, легких, яичниках, маточных трубах, предстательной железе. Поэтому уровень амилазы может быть повышен при целом ряде заболеваний, имеющих сходную картину с острым панкреатитом: остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки, кишечной непроходимости, холецистите, тромбозе брыжеечных сосудов, а также при феохромоцитоме, диабетическом ацидозе, после операций по поводу пороков сердца, после рзекции печени, приеме больших доз этанола, употребления препаратов опия, сульфаниламидов, морфина, тиазовых диуретиков, пероральных контрацептивов. Повышение амилазной активности при этих заболеваниях обусловлено рядом причин и носит в большинстве случаев реактивный характер. Вследствие значительных запасов амилазы в ацинарных клетках любое нарушение их целости или малейшее затруднение оттока секрета поджелудочной железы может привести к значительному попаданию амилазы в кровь. У больных перитонитом увеличение амилазной активности является следствием развития образующих амилазу бактерий. Обычно активность альфа-амилазы при перечисленных заболеваниях повышается в крови в 3–5 раз.

Активность слюнной амилазы увеличивается в сыворотке крови при пневмониях, стоматитах, невралгии лицевого нерва, паркинсонизме, раке легкого, яичника, остром инфаркте миокарда, черепно-мозговой травме, диабетическом кетоацидозе. Однако это увеличение не бывает значительным. Уменьшение слюнной амилазы отмечается при психическом возбуждении или депрессии, при анацидном состоянии желудочной секреции.

Снижение активности альфа-амилазы в крови может быть обнаружено при тиреотоксикозе, инфаркте миокарда, некрозе поджелудочной железы.

У некоторых пациентов может иметь место высокая амилазная активность сыворотки крови из-за низкой экскреции фермента с мочой. Характерно, что при этом почечная фильтрация в норме. Этот симптомокомплекс объясняется связыванием амилазы с сывороточными белками или с агрегацией фермента. Макромолекулярные комплексы, обладающие амилазной активностью, обозначаются как макроамилаза. Это чаще всего результат амилазы с иммуноглобулинами (амилаза – IgA). В связи с присутствием в крови пациента макроамилазы могут возникать проблемы при интерпретации результатов. Дело в том, что эта форма может существовать в крови многие годы и выявляться как у пациентов с нормальной, так и повышенной активностью амилазы. В случаях гиперамилаземии этот комплекс определяется в 3–10 % случаев. Размер молекулы макроамилазы (210 кДа) гораздо больше, чем α-амилазы, в результате она не попадает в мочу и аккумулируется в крови независимо от клинического состояния больного. Имеются данные, что при наличии макроамилазы определение

22

панкреатического изофермента методом иммунопреципитации может дать ложноположительный результат. Это происходит потому, что макроамилазные комплексы не связываются антителами и, следовательно, определяются на втором этапе, как панкреатическая амилаза. Влияние макроамилазы на конечный результат определения активности панкреатического изофермента считается ошибкой метода, возникающей из-за невозможности полного связывания амилазы из слюнных желез соответствующими антителами. Присутствие макроамилазы может проявиться при электрофорезе, что затрудняет интерпретацию результатов.

Самым простым способом выявления присутствия макроамилазы является расчет соотношения комплексов амилазы и эндогенного креатинина по следующей формуле

В норме это соотношение составляет 1–4 %. При наличии макроамилазы это значение становится ниже 1 %, при гиперамилаземии другой этилогии (включая острый панкреатит) – значение повышается до 7–10 %.

Каждый случай выявления макроамилазных комплексов у пациента должен быть зафиксирован в истории болезни, и пациент должен быть информирован об этом.

Аминотрансферазы

Аспартатаминотрансфераза (КФ 2.6.1.1. L-аспартат: 2-оксоглутарата-

минотрансфераза, АСТ или АсАТ или более редкое название глутаматоксалоацетаттрансаминаза (ГОТ).

Аланинаминотрансфераза (КФ 2.6.1.2. L-аланин: 2-оксоглутарата-

минотрансфераза, АЛТ или АлАТ или более редкое название глутаматпируваттрансаминаза (ГТП).

Нормальные величины активности ферментов в сыворотке / плазме – АсАТ: 10–30 МЕ/л и АлАТ: 7–40 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002).

Аминотрансферазы катализируют процессы трансаминирования, они распределены по всем органам и тканям. АсАТ имеет изоферменты, локализованные как в цитозоле, так и в митохондриях, АлАТ – энзим преимущественно цитоплазматический, митохондриальная форма его нестабильна, и ее содержание в клетке низкое. Роль кофермента в трансаминазных

реакциях играет пиридоксальфосфат (витамин В6).

АсАТ в высоких концентрациях присутствует в клетках сердечной и скелетных мышц, печени, почках, поджелудочной железе и эритроцитах. Поражение любого из этих органов и тканей может привести к существенному повышению АсАТ в сыворотке крови. Наиболее резкие изменения

23

АсАТ наблюдаются при поражении сердечной мышцы. Так, при инфаркте миокарда активность АсАТ в сыворотке крови может повышаться в 4– 5 раз. При остром инфаркте миокарда ее активность повышается у 93–98 % больных и имеет такую же динамику, как и МВ изофермент креатинкиназы, но степень увеличения активности АсАТ несколько меньшая. Считается, что между размерами очага инфаркта и активностью АсАТ в сыворотке имеется тесная корреляция. Если в течение нескольких дней не происходит нормализация активности фермента, это свидетельствует о расширении зоны инфаркта. У лиц моложе 60 лет активность АсАТ, как правило, выше, чем у лиц более пожилого возраста, поэтому высокая активность АсАТ у пожилых людей может быть расценена как проявление обширного инфаркта миокарда и является плохим прогностическим признаком. Повышение активности АсАТ характерно также для печеночных патологий. Так, значительное повышение активности фермента имеет место при остром вирусном и токсических гепатитах. Умеренное повышение может иметь место при циррозе печени (в 2–3 раза), механической желтухе, метастазах опухоли в печень. Это может наблюдаться при поражении скелетной мускулатуры, например при прогрессирующей мышечной дистрофии; при панкреатите; выраженном внутрисосудистом гемолизе. Следует иметь в виду, что у новорожденных активность примерно в 1,5 раза выше, чем у взрослых.

Снижение активности АсАТ имеет место при недостаточности пиридоксина (витамина В6), при почечной недостаточности, при беременности.

АлАТ в высоких концентрациях присутствует в клетках печени и в меньшей степени в скелетных мышцах, почках и сердце. Повышение активности АлАТ наиболее часто отмечается при острых заболеваниях печени и желчных путей. Активность АлАТ резко повышается у больных острыми вирусными гепатитами в ранние сроки болезни: приблизительно у 50 % больных она увеличивается за 5 дней до появления желтухи и гепатомегалии, у 90 % больных – за 2 дня до появления этих симптомов. Пик ферментативной активности опережает максимальный уровень билирубина в крови на 7–10 дней и совпадает с появлением желтухи, т.е. периодом максимальной тяжести болезни (превышение нормы в 20– 50 раз). В неосложненных случаях уровень активности как АлАТ, так и АсАТ снижается до нормальных значений к исходу 8 недели болезни примерно у 75–80 % больных. У небольшой части больных после нормализации наблюдается второй пик повышения активности аминотрансфераз, это сопровождается клиническим рецидивом болезни. Длительное повышение активности аминотрансфераз или увеличение ее в поздние сроки болезни может означать развитие печеночного некроза. Длительное незначительное увеличение ферментативной активности в части случаев свидетельствует о хронизации процесса (хронический гепатит, цирроз).

24

Отношение АсАТ/АлАТ называется коэффициентом де Ритис. В норме он составляет 1,3 ± 0,4 (Назаренко Г.И. и др., 2002), при заболеваниях печени – ниже этой величины, а при заболеваниях сердца – выше. Так, при вирусных гепатитах его значение уменьшается и составляет 0,55–0,65. В разгар болезни, при высоких значениях активности той или другой трансаминазы, коэффициент де Ритис составляет в среднем 0,83, что отражает более глубокие разрешения гепатоцитов и выход митохондриальной АсАТ в кровяное русло. В дифференциально-диагностическом отношении имеет некоторое значение то, что при алкогольных поражения печени в противоположность вирусным характерно преимущественное повышение активности АсАТ и коэффициента де Ритис более 2. Значение данного коэффициента выше нормы часто наблюдается при обтурационных желтухах, холециститах, циррозах, когда абсолютные значения АлАТ и АсАТ невелики.

Повышение активности трансаминаз возможно при воспалительных заболеваниях различных органов и тканей (например, поджелудочной железы, при мышечных дистрофиях и т.д.). Подобные гиперферментемии не имеют, разумеется, самостоятельного диагностического значения, но должны учитываться при трактовке трансаминазного теста.

Снижение активности АлАТ может иметь место при тех же условиях, что и уменьшение активности АсАТ.

В настоящее время считают, что в рамках концепции повышения активности аминотрансфераз по причине некроза гепатоцитов и мышечных клеток существует ряд противоречий (Якунин Д.Ю. и др., 2002).

Во-первых, при гепатитах зачастую активность АлАТ повышается более чем в 100 раз, что может происходить только при глубокой степени деструкции паренхимы органа, что не согласуется с данными биопсии. Вовторых, для АлАТ обнаружен «феномен разведения» – нелинейное падение активности фермента при разведении сыворотки, то есть, наряду с простой диффузией фермента из разрушенной ткани существует как минимум еще один механизм изменения активности. В-третьих, в ткани печени описано присутствие «митохондриального» изофермента АлАТ, который практически не обнаруживается в сыворотке крови даже при значительном некрозе гепатоцитов. При этом в сыворотке крови наблюдается увеличение количества и «митохондриальной» и «цитозольной» изоформ другой трансаминазы – АсАТ.

Но наиболее сильные противоречия наблюдаются при попытках соотнести концентрацию фермента, его активность и клиническую картину. Были предприняты попытки создать иммуноферментные системы для определения АсАТ, однако корреляция между активностью и иммунореактивной концентрацией фермента отсутствовала.

Не смотря на очевидные противоречия, теория связи лизиса клеток с увеличением активности трансаминаз до сих пор является господствующей. Основными причинами такой ситуации можно считать простоту ба-

25

нального «объяснения», отсутствие концептуального понимания функциональной роли АлАТ и АсАТ в циркулирующей крови, а также не изученность механизма регуляции сывороточной активности этих ферментов.

Основной внутриклеточной ролью АлАТ принято считать участие в сопряжении метаболизма аминокислот и цикла трикарбоновых кислот. Для более изученного фермента – АсАТ известно несколько функций. При этом основными функциями этого фермента являются участие в цикле мочевины и в малат-аспартатном шунте, через мембрану митохондрий. Все эти метаболические пути локализованы внутри клетки, а соответственно, и ферменты для выполнения своей физиологической роли должны находится в клетке. На данный момент неизвестно ни одного природного ингибитора трансаминаз, который бы мог обеспечивать регуляцию ферментативной активности и объяснить отсутствие корреляции между концентрацией и активностью фермента. Вследствие отсутствия сведений о диапазоне возможной «естественной» регуляции, в большинстве случаев о количественном содержании этих ферментов в органах, тканях и крови судят только на основании измерения их активности.

Какова же возможная физиологическая роль трансаминаз в крови человека? Рядом исследователей была предпринята попытка обнаружения феномена аллостерической регуляции активности ферментов в периферической крови, как одного из условий проявления физиологической роли трансаминаз.

Как уже упоминалось выше, для АсАТ известно участие в процессах трансмембранного переноса. Этот процесс обычно рассматривается как необходимый для переноса восстановительных потенциалов через митохондриальную мембрану и регенерации НАДH, образованного в результате гликолиза. Однако путь утилизации НАДH в митохондрии не всегда возможен. Например, эритроциты не имеют митохондрий и поэтому им необходимо утилизировать НАДH другим способом. Гликолитический путь получения энергии характерен также и для мышцы в условиях недостатка кислорода. В этой ситуации для регенерации НАДH необходим малат-аспартатный шунт, между цитозолем и межклеточной жидкостью, с последующим транспортом восстановительных потенциалов в печень для дальнейшего окисления в дыхательной цепи. Вторым продуктом гликолиза, который необходимо удалять из клетки в случаях невозможности окисления, является пируват. Пируват и лактат имеют крайне низкую скорость трансмембранного переноса, но L-аланин легко переносится через мембрану. И именно АлАТ может обеспечить образование L- аланина из пирувата. Необходимо также учесть, что печень очень активно поглощает L-аланин в качестве субстрата. Это обусловлено высокой интенсивностью цикла мочевины и глюконеогенеза. В то же время показано, что печень в незначительной степени метаболизирует глюкозу до пировиноградной кислоты, т.е. интенсивность гликолиза в ней не высока.

26

Глюкоза, поступающая в печень, перерабатывается в гликоген, в связи с этим можно считать, что наиболее предпочтительным энергетическим субстратом для печени является пируват, а прохождение через мембрану может быть обеспечено в форме L-аланина. Способность печени поглощать L-аланин, в концентрациях в 20 раз превышающих физиологическую норму, показано в опытах с перфузией печени. Если принять именно такое участие АлАТ и АсАТ в процессах перераспределения энергетических субстратов между органами, то меняется и отношение к повышению активности этих ферментов при патологических процессах. Фактически можно предположить, что повышение активности трансаминаз связано либо с необходимостью отведения продуктов гликолиза от органов, оказавшихся в условиях гипоксии, либо с повышением энергетических затрат печенью. В этом контексте повышение активности трансаминаз вовсе не свидетельствует только о лизисе клеток.

На основании этого можно сделать предположение, что «стертые» формы гепатита, вообще не сопровождаются процессом разрушения печени, и организм успешно справляется с патологическим процессом самостоятельно. Это объясняет также и тот факт, что активность трансаминаз повышается раньше появления в крови других ферментов, специфичных только для внутриклеточного пространства.

Гамма-глутамилтрансфераза

Гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ; КФ 2.3.2.2) катализирует пере-

нос гамма-глутамилового остатка с гамма-глутамилового пептида на аминокислоту, другой пептид или иной субстрат. В организме человека фермент участвует в метаболизме глутатиона – пептида, состоящего из остатков глутаминовой кислоты, цистеина, глицина, который играет важную роль во многих обменных процессах. Тест по определению активности ГГТ в последнее время приобретает все большее значение в диагностике заболеваний печени и гепато-билиарного тракта, т. к. отличается большей чувствительностью, чем применяемые с этой целью тесты на АлАТ, АсАТ и ЩФ.

Наиболее высокая активность ГГТ обнаружена в почках – в 7000 раз выше, чем в сыворотке крови. Содержание ГГТ в сыворотке крови здорового человека обычно незначительно и связано с ее экскрецией из клеток печени, где активность фермента в 200–500 раз выше. Кроме того, ГГТ содержится в клетках поджелудочной железы (в 600 раз выше, чем в сыворотке крови). Незначительная активность фермента регистрируется в кишечнике, мозге, сердце, селезенке, простате и скелетных мышцах. В клетке ГГТ локализована в мембране, лизосомах и цитоплазме, причем мембранная локализация фермента характерна для клеток с высокой секреторной, экскреторной или (ре)абсорбционной способностью. Референтные значения активности фермента в сыворотке крови в зависимости от возраста и пола представлены в таблице 1.

27

Активность ГГТ в сыворотке крови повышается при любых патологиях печени и желчных путей, и, напротив, при нормальной активности фермента вероятность заболевания печени очень мала. В зависимости от механизма повреждения печени степень увеличения активности ГГТ в сыворотке крови, как правило, заметно отличается, что позволяет успешно использовать этот маркер для дифференциальной диагностики заболеваний печени.

Таблица 1

Референтные значения активности фермента в сыворотке крови

Существенное увеличение активности ГГТ наблюдается при холестазе, и лишь незначительное – при повреждении паренхимы печени (некрозе гепатоцитов). Поскольку в последнем случае, как уже указано выше, резко возрастает активность АлАТ, то определение индекса АлАТ/ГГТ позволяет с высокой достоверностью дифференцировать острый вирусный и обструктивный гепатиты. У больных хроническим гепатитом активность ГГТ увеличена в 75 % случаев, в то время как показатели АлАТ могут находиться на уровне нормальных значений. Поэтому тест на ГГТ с большей достоверностью подтверждает диагноз заболевания.

Гамма-глутамилтрансфераза – более информативный маркер поражения гепатобилиарной системы, чем ЩФ. Активность ГГТ возрастает в более ранние сроки заболеваний и удерживается на повышенных уровнях более длительное время, причем относительное увеличение активности ГГТ выше, чем ЩФ. Кроме того, ГГТ – высокоспецифичный индикатор поражения печени, поскольку в отличие от ЩФ, ее активность у здоровых детей, беременных женщин и пациентов с заболеваниями костной системы находится на уровне нормальных значений.

Определение активности ГГТ имеет большое значение для дифференциации желтух. При паренхиматозной желтухе, свойственной инфекционным и токсическим заболеваниям с поражением паренхимы печени, активность ГГТ повышается обычно лишь в незначительной степени (в

28

2–3 раза). У всех больных с обтурационной (механической) желтухой, вызванной нарушениями оттока желчи по желчевыводящим путям, такими как закупорка желчных протоков камнем, сдавливание их опухолями, увеличенными лимфоузлами и др., активность ГГТ в сыворотке крови превышает верхнюю границу нормы в 15–140 раз.

Весьма важной сферой применения теста для определения ГГТ является онкология. Показано, что у 100 % больных злокачественными опухолями с метастазами в печень (с наличием желтухи и без нее) активность ГГТ в сыворотке крови значительно (в 12 и более раз) повышена. В то же время у больных без метастазов в печень активность данного фермента превышает норму, в основном, лишь при наличии заболеваний гепатобилиарной системы неопухолевого происхождения.

Определение активности ГГТ используется для диагностики алкогольного поражения печени, а также для контроля лечения алкоголизма. Алкоголь усиливает продукцию ГГТ в печени и способствует ее выходу из клеточных мембран, что приводит к повышению активности фермента в сыворотке крови даже при отсутствии патологии печени. При прекращении злоупотребления алкоголем уровень активности ГГТ постепенно снижается (через 10 дней на 50 %) и затем приходит в норму. Поэтому тест на ГГТ позволяет проконтролировать добросовестность лечения от алкоголизма. Если прием алкоголя однозначно прекращен, а активность ГГТ у бывшего алкоголика не снижается, то высока вероятность наличия у него алкогольного гепатита или цирроза печени.

Ряд наркотиков и лекарственных препаратов (нестероидные противовоспалительные препараты, диклофенак, парацетамол, барбитураты и др.) также индуцирует активность ГГТ в печени. Поэтому мониторинг ГГТ в сыворотке крови больных используется для выявления гепатотоксического действия препаратов и своевременного изменения лечебного курса.

Кроме основного использования в качестве «печеночной» пробы тест по определению активности ГГТ применяется для диагностики заболеваний поджелудочной железы. Причем в странах Западной Европы в последнее время он используется чаще, чем тест на альфа-амилазу – традиционный маркер патологий поджелудочной железы. Это связано с тем, что у 100 % больных, страдающих острым панкреатитом, активность ГГТ в сыворотке крови, как правило, в 10–20 раз превышает нормальные значения.

Новой областью применения данного теста является лабораторная диагностика заболеваний почек. Показано, что при пиелонефрите, гломерулонефрите, почечнокаменной болезни активность ГГТ в моче больных существенно возрастает. Определение активности фермента в моче позволяет диагностировать начальные стадии патологии почек, сопровождающиеся поражением проксимальных отделов канальцев.

29

Анализ сводных данных об активности «печеночных» ферментов в сыворотке крови при некоторых заболеваниях и состояниях (табл. 2) показывает, что активность ГГТ является высокочувствительным индикатором заболеваний печени, желчевыводящих путей и поджелудочной железы. Особенно эффективно применение данного маркера в диагностике в комплексе с другими ферментами печеночного профиля.

Таблица 2

Активность «печеночных» ферментов при различных заболеваниях и состояниях

30