posobie_po_veterinarnoy_virusologii

31

-готовят 10% суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса;

-центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надоса-

дочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками

широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, цефазолин,

гентамицин);

-материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;

-при отрицательном результате бактериологического контроля проводят исследование вируссодержащей суспензии; в случае положительного бактерио-

логического контроля суспензию дополнительно обрабатывают антибиотиками и повторно ставят контроль.

Суспензию хранят при температуре минус 20-70°С.

2. Приготовление вируссодержащей суспензии из смывов, соскобов.

-тампон отполаскивают в транспортной среде, отжимают;

-центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;

-материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;

-из осадка делают мазок для постановки РИФ.

3. Приготовление вируссодержащей суспензии из фекалий.

-фекалии гомогенизируют в фосфатно-буферном растворе;

-центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадоч-

ную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками ши-

рокого спектра действия;

- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.

4. Приготовление вируссодержащей суспензии из кожных поражений.

- стенки папул, корочки растирают с фосфатно-буферным раствором;

32

- центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадоч-

ную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками ши-

рокого спектра действия;

- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.

5. Кровь используют цельную с антикоагулянтом, её замораживают и после оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, освобождают от контаминантов антибиотиками широ-

кого спектра действия и подвергают бактериологическому контролю. Чаще ис-

пользуют «лаковую» кровь, получаемую смешиванием равных объёмов крови и дистиллированной воды.

6. Для получения проб сыворотки кровь без антикоагулянтов выдержи-

вают при комнатной температуре (или в термостате) до образования сгустка,

обводят сгусток для отделения от стенок, помещают в холодильник на 18-20

час. и затем отбирают сыворотку стерильно, добавляют антибиотики широкого спектра действия. Хранят при температуре +4°С или замораживают.

Готовую вируссодержащую суспензию исследуют в соответствии с эта-

пами вирусологического исследования по следующему плану, который включа-

ет следующие задачи:

1.Индикация (обнаружение) вируса в патматериале;

2.Изоляция (выделение) вируса из патматериала;

3.Идентификация (определение вида) выделенного вируса;

4.При необходимости – доказательство этиологической роли выделен-

ного вируса

5.Ретроспективная диагностика.

Лабораторную диагностику проводят в соответствии с методическими указаниями или наставлениями по диагностике конкретной вирусной болезни,

утверждёнными Департаментом ветеринарии Минсельхоза России. В соответ-

ствии с ними на каждом этапе используют только определённые для каждой

33

инфекции методы, диагностические наборы для которых выпускает биологическая промышленность России.

На первом этапе проводят индикацию вируса в вируссодержащей суспензии (мазках-отпечатках). Независимо от полученного результата в дальнейшем проводят второй этап - изоляцию методом биологической пробы в трёх «слепых» пассажах. Пассаж – это заражение живой системы, с целью получения новой популяции вируса. «Слепой» пассаж – заражение без видимых признаков репродукции вируса. Через три пассажа в клетках живой системы происходит накопление вируса, что сопровождается появлением признаков репродукции, видимых на уровне макроорганизма. Например, при биопробе на животных: клинические признаки, гибель, патизменения; на куриных эмбрионах – гибель, патизменения, гемагглютинация; на культуре клеток – ЦПД, гемадсорбция. Такие зараженные живые системы определяют как положительная биопроба. Однако точно установить вид инфекционного агента еще нельзя. Поэтому от положительной биопробы отбирают патологический материал, который условно считают вторичным, т.е. отобранным из живой системы с признаками положительной биопробы. Из него готовят вируссодержащую суспензию или мазки-отпечатки (выделенный вирус) и на третьем этапе проводят его идентификацию в серологических реакциях (см. таблицу №3) или методом ПЦР-анализа.

В некоторых случаях после выделения вируса требуется доказать его роль (этиологическая роль) в возникновении вспышки заболевания. Обычно это касается тех вирусов, которые могут находиться в организме животного и не вызывать болезнь при отсутствии предрасполагающих и осложняющих факторов. В этом случае на четвёртом этапе исследований проводят серологические реакции, в которых в качестве антигена используют выделенный вирус и в качестве антител – парные пробы сыворотки крови в двукратных последовательных разведениях. Положительным результатом, доказывающим этиологическую роль выделенного вируса, является увеличение титра антител во второй пробе сыворотки крови по сравнению с первой в 4 и более раз.

Примечание: АТ* - специфические антитела, меченые флуорохромом (конъюгат); АТф - специфические антитела, меченые ферментом (конъюгат); антивидовые АТ*и антивидовые АТф - антивидовые конъюгаты.

РДП, РИФ, ИФА, РНГА, РСК относят к экспресс-методам лабораторной диагностики; РН, РТГА и РТГАд не относят к экспресс-методам.

35

Отдельным этапом в лабораторной диагностике вирусных болезней яв-

ляется ретроспективная серодиагностика, т.е. диагностика, проводимая по пар-

ным пробам сыворотки крови на этапе выздоровления («ретро»). Она играет очень важную роль, т.к. в большинстве случаев крайне трудно выделить вирус и провести его идентификацию. С этой целью используют парные пробы сыво-

ротки крови, которые исследуют в серологических реакциях со стандартным специфическим антигеном в соответствии с предварительным диагнозом на ви-

русную болезнь. Нарастание в 4 и более раз титра антител во второй пробе по сравнению с первой свидетельствует об активном инфекционном процессе,

протекающем в организме животного в период взятия у него крови. При этом болезнь вызвана тем вирусом, к которому установлено повышение титра анти-

тел в парных пробах сыворотки.

Основными требованиями современной диагностики вирусных болез-

ней являются высокая специфичность и чувствительность лабораторного мето-

да, быстрота постановки диагноза, удобство в проведении исследования, сни-

жение себестоимости, минимальное приборное обеспечение. Всем этим пара-

метрам отвечают такие современные методы экспресс-диагностики, как имму-

ноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР-анализ).

Иммуноферментный анализ (ИФА), в основе которого лежит высоко-

специфическое взаимодействие антигенов (АГ) с антителами (АТ), используют в современной ветеринарной лабораторной практике при решении целого ряда задач.

Использование ИФА

36

3. Этиологический анализ эпизоотии 3. Оценка напряжённости поствакци- (мониторинг) и изучение его закононального иммунитета у животных мерностей

4. Определение уровня колостральных антител у животных первых дней жизни

5. Изучение механизмов формирования иммунитета и роли различных факторов иммунной системы в патогенезе вирусных болезней

Для этих целей выпускают диагностические наборы для определения АГ

(методами сэндвич-, конкурентного и ингибиторного ИФА) и АТ (методом не-

прямого ИФА).

Сэндвич-ИФА 1.АТ специфические (стандарт) в буферном растворе иммобилизируют в лунках планшета (подложка). Отмы-

вают неадсорбированные АТ.

2.Добавляют исследуемый АГ, который связывается с АТ. Несвязавшиеся белки удаляют отмыванием.

3.Вносят специфический коньюгат (специфические АТ,

меченные ферментом, например пероксидазой – АТ-Ф).

Отмывают не связавшиеся АТ-Ф

4. Добавляют субстрат (субстратно-хромогенная смесь,

например: Н2О2 + бензидин), который под влиянием фер-

мента в составе АТ-Ф (например: пероксидаза хрена)

превращается в продукт цветной реакции.

5. Учет реакции (качественное и количественное содер-

жание АГ) проводят по определению окрашенного про-

дукта реакции путем сканирования оптической плотности

(ОП). Зависимость между ОП и АГ прямопропорцио-

нальная: чем больше исследуемого АГ содержится в рас-

творе, тем больше связывается АТ-Ф и выше значение ОП.

37

Конкурентный ИФА 1. АГ (стандарт) иммобилизируют на подложке.

Отмывают не адсорбированный АГ.

2. Добавляют исследуемый АГ и АТ-Ф.

Несвязавшиеся белки удаляют отмыванием.

3. Добавляют субстрат. При этом АГ ингибирует связы-

вание АГ-Ф с АТ на подложке.

4. Сканируют ОП. Зависимость между ОП и АГ обратно-

пропорциональная: чем больше исследуемого АГ содер-

жится в растворе, тем меньше связывается АГ-Ф и ниже значение ОП.

38

Информация обо всём многообразии свойств любого организма заклю-

чена в его генетическом материале. Геном вирусов, как и других биологических объектов, является той уникальной структурой, которая наиболее полно и адек-

ватно отражает биологическую сущность данного вируса, является его исчер-

пывающей характеристикой на молекулярном уровне. Поэтому использование информации, заложенной в структуре нуклеиновых кислот, является надёжным критерием их идентификации. С этой целью можно использовать методы, по-

зволяющие выявлять специфические фрагменты генома возбудителя болезни,

на основании которых и делается заключение о наличии или отсутствии этого возбудителя в исследуемом материале. Одним из таких методов является поли-

меразная цепная реакция (Polymerase chain reaction – PCR).

Полимеразная цепная реакция, более известная как "ПЦР" не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б.

Мюллисом в 1983 году, за что в 1995 г. он был удостоен Нобелевской премии.

Причина достаточно проста: ПЦР делает невозможное возможным.

Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут нахо-

дить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. "Иглой" является кро-

шечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаружи-

вает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНКрепли-

кацию, делает его копии. В результате в течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить генетический материал, присутст-

вующий в минимальных количествах.

ПЦР - это циклический процесс, принцип которого сводится к следую-

щему: молекулу ДНК подвергают температурному плавлению при температуре

95ºС (денатурация) для расплетения двойной цепи ДНК; затем при охлаждении до 56-62ºС праймеры комплементарно присоединяются к специфическому фрагменту одноцепочечной ДНК (отжиг праймеров) и при последующем по-

вышении температуры до 72ºС начинается ферментативный процесс достройки

(синтеза, элонгации) молекулы ДНК при участии фермента Taq-полимеразы.

39

Эти три операции составляют один цикл ПЦР и приводят к удвоению количе-

ства ДНК в исследуемом образце с последующей детекцией продуктов ампли-

фикации методом горизонтального электрофореза.

Стандартный цикл ПЦР – денатурация, отжиг праймеров и элонгация – воспроизводится многократно и количество специфических фрагментов ДНК

(ДНК-ампликонов) растёт в геометрической прогрессии, причём любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза новых моле-

кул в последующих циклах ПЦР.

Основными компонентами ПЦР являются:

1. Термостабильный фермент Taq-ДНК-полимераза, первоначально вы-

деленный из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus, сохраняет свою ферментативную активность при многократных нагреваниях до 95°С, что дало возможность проведения реакции в автоматическом режиме в амплифика-

торе.

2. Праймеры - искусственно синтезированные одноцепочечные ДНК размером 20-30 нуклеотидов, комплементарные участкам матричной ДНК, ме-

жду которыми находится последовательность-мишень, и ориентированы таким образом, что синтез протекает только между ними, обеспечивая удвоение иско-

мого фрагмента. Нуклеотидная последовательность праймеров подбирается та-

ким образом, чтобы она была статистически уникальна и не встречалась в двух участках ДНК, присутствующих в реакционной смеси.

3. Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), служа-

щие материалом для синтеза ДНК.

4. Магний - необходим для функционирования фермента Таq-ДНК-

полимеразы.

5. Буфер для ПЦР обеспечивает оптимальные условия для работы фер-

мента. Наиболее распространен Трис-НСl-буфер, который удерживает рН во время амплификации между 6,8 и 7,8.

6. Суммарная ДНК

40

В последнее время более широкое распространение получил усовер-

шенствованный метод ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Поскольку накопление продуктов амплифика-

ции зависит от исходной концентрации ДНК, то с помощью этой технологии можно получить количественные характеристики исследуемых нуклеиновых кислот с автоматизацией полученных результатов. Эта модификация метода ПЦР позволяет проводить детекцию продуктов амплификации во время реак-

ции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. Детекция продуктов амплификации проводится в реакционном растворе за счет специфичной гиб-

ридизации продукта с олигонуклеотидным зондом, несущим флуоресцентную метку. В процессе реакции происходит высвобождение флуоресцентной метки в раствор, что дает возможность ее определения на флуоресцентном детекторе.

Данный способ детекции является альтернативой методу электрофореза и име-

ет два основных преимущества - возможность проведения реакции амплифика-

ции и детекции в одном приборе, что существенно снижает риск контаминации и значительно сокращает риск ошибки оператора и возможность количествен-

ной оценки исходной ДНК матрицы.

Преимуществом ПЦР является то, что этот метод позволяет выявить генетический материал непосредственно самого возбудителя, даёт возможность амплифицировать искомый участок нуклеиновых кислот, даже если анализируемый материал содержит сложную смесь молекул, возможен анализ препаратов, содержащих деградированную ДНК. Для диагностики многих болезней методом ПЦР не требуется сохранения целостности структур возбудителя и его биологической активности. В качестве источника нуклеиновых кислот подходит любой биологический и патологический материал.

Эффективность, простота исполнения, высокие показатели чувствитель-

ности и специфичности предопределили широкие возможности практического применения метода ПЦР в различных областях медицины и ветеринарии. В на-

стоящее время ПЦР широко используют при диагностике инфекционных бо-