Сиволоб. Молекулярна біологія

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

Інший блок – хромодомен – упізнає метильовані Lys. Гістонові хвости слугують своєрідними платформами для збирання різноманітних білкових комплексів, склад яких залежить від патерну модифікацій

– розподілу певних модифікованих груп по хвостах. Співвідношення між патерном модифікацій і набором білків, які впізнають такий патерн, що у свою чергу має певні функціональні наслідки, на-

зивають гістоновим кодом.

R2 K4 K9 R17

K27

K5

H3

K15 K12

K20

K9 K14

K18

H2A

Рис. 4.13. Кінцеві хвости гістонів у структурі нуклеосоми (1KX5) та їхні модифікації. Кольором виділено по одному N-кінцевому хвосту

кожного гістону, а також С-кінцевий – гістону Н2А (поряд із N-кінцем Н3). Стрілочками вказано ацетилювання (червоні), метилювання (зелені)

і фосфорилювання (блакитні) залишків певного типу, які займають певні позиції в поліпептидних ланцюгах

Наприклад, фосфорилювання Н3-Ser10 із одночасним ацетилюванням Н3-Lys14 супроводжується активацією транскрипції, деацетилювання Н3-Lys14 із одночасним метилюванням Н3-Lys9 – репресією. Це лише невеличкий елемент такого коду: зрозуміло, що різноманітних комбінації модифікованих залишків на восьми гістонових хвостах (рис. 4.13) може бути велика кількість. Остаточне з'ясу-

123

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

вання гістонового коду ще далеко не завершено. Певні його закономірності та інші приклади залучення гістонового коду до регуляції транскрипції наведені у розділі 6.

Гістон Н1

Одна молекула п'ятого гістону – лінкерного гістону Н1 – взаємодіє з кожною нуклеосомою у хроматині. Проте ця взаємодія, на відміну від корових гістонів, є динамічною: спостерігається швидкий обмін лінкерних гістонів між хроматином та їхнім пулом у ядрі.

GH1

N C

C

N

Рис. 4.14. Схема будови гістону Н1

і структура його глобулярного домену GH1 (1HST, аналог гістону Н1 з еритроцитів птахів, що позначається як Н5)

За своєю структурою гістон Н1 (мономерний білок) суттєво відрізняється від корових гістонів (рис. 4.14). Молекула Н1 містить N-кінцевий невпорядкований хвіст, глобулярний домен GH1 і довгий, збагачений позитивно зарядженими залишкам (насамперед Lys) С-кінцевий хвіст довжиною приблизно 100 амінокислотних залишків (приблизно половина молекули). Глобулярний домен (приблизно 80 амінокислот) належить до так званої родини “спіральних із крильцем” (winged helix) ДНК-зв'язувальних білків.

На поверхні домену існують два можливі сайти взаємодії з ДНК, які формуються кластерами позитивно заряджених амінокислот і локалізовані на протилежних боках глобули. Відповідно, глобулярний

124

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

домен взаємодіє з нуклеосомною ДНК на виході з нуклеосоми, імовірно, між двома сусідніми витками (рис. 4.15, а), додатково стабілізуючи нуклеосомну суперспіраль. С-кінцевий хвіст Н1 взаємодіє з обома лінкерами, що виходять з нуклеосоми. У результаті дві лінкерні ділянки (довжиною по 10–30 пар основ) утворюють стеблоподібну структуру на виході з нуклеосоми (рис. 4.15, б).

Рис. 4.15. Схема взаємодії глобулярного домену GH1 (а) та цілого гістону Н1 (б) із нуклеосомою

Наднуклеосомна упаковка хроматинової фібрили

Ухроматині нуклеосоми з'єднані лінкерами довжиною ~50 пар основ. Якщо лінкер (у полінуклеосомному ланцюзі без гістону Н1) просто продовжує хід нуклеосомної ДНК по прямій, нуклеосоми у складі полінуклеосомної нитки мають бути розташовані зиґзаґом (рис. 4.16, а).

Саме такий вигляд має декомпактизована (якщо відсутній Н1 і за низької іонної сили) полінуклеосомна фібрила під мікроскопом (електронним чи атомно-силовим). Товщина такого зиґзаґу дорівнює приблизно 30 нм. Полінуклеосомний зиґзаґ може конденсуватися (рис. 4.16, б). Умова конденсації (необхідна, але недостатня) – фізіологічна іонна сила (крім одновалентних мають бути присутніми двовалентні катіони) для зниження електростатичного розштовхування між нуклеосомами. Фактор конденсації (її рушійна сила) – невпорядковані хвости корових гістонів: лабільні позитивно заряджені хвости ефективно “зшивають” фібрилу, взаємодіючи з ДНК сусідніх нуклеосом.

Уприсутності гістону Н1 компактна хроматинова фібрила товщиною 30 нм стає значно стабільнішою. Ключова роль у цій стабілізації належить стеблу, що формується унаслідок взаємодії з гістоном Н1 двох лінкерних ділянок на виході з нуклеосоми: за рахунок стебла сусідні нуклеосоми значно зближуються, що сприяє конденсації (рис. 4.17). Отже, присутність Н1 наближає нуклеосоми одна до одної у складі фібрили, чим сприяє “зшиванню” цих нуклеосом хвостами

125

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

корових гістонів. І навпаки, компактизація фібрили за участю хвостів корових гістонів сприяє зв'язуванню Н1 із наближеними у просторі ділянками лінкерів.

Рис. 4.16. Зиґзаґоподібна конфігурація полінуклеосомної нитки (а)

іструктура компактизованого елемента такої нитки

укристалах тетрануслеосом (б, 1ZBB)

+ Н1

Рис. 4.17. Роль Н1-залежного стебла на виході з нуклеосоми у стабілізації компактного стану хроматинової фібрили.

Отже, суперструктура конденсованої фібрили товщиною 30 нм являє собою тривимірний зиґзаґ нуклеосом, з'єднаних практично прямими – без вигинів – лінкерами, які спрямовані всередину фібрили. Усередині містяться також і гістони Н1; сумісна дія Н1 і хвостів корових гістонів підтримує компактний стан фібрили.

Фібрила товщиною 30 нм – основна форма існування інтерфазного хроматину. Але у хроматині існує значна гетерогенність за ступенем конденсації. З одного боку, передумовою активації окремих ділянок хроматину є деконденсація фібрили. Факторами такої деконденсації є зниження спорідненості до ДНК хвостів корових гістонів унаслідок їхнього ацетилювання (зниження позитивного заряду) і тимчасова дисоціація Н1. Дисоціації Н1 сприяє ацетилю-

126

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

вання хвостів корових гістонів, а також посттрансляційні модифікації самого Н1, зокрема фосфорилювання. Деконденсація фібрили та дисоціація Н1 створюють можливість взаємодії з ДНК різноманітних негістонових білків, що врешті-решт і викликає активацію транскрипції (див. розділ 6).

З іншого боку, у репресованих ділянках хроматинова фібрила може бути як додатково стабілізованою в компактному стані, так і піддаватися компактизації вищого порядку. Частина хроматину, що зберігає стан підвищеної компактизації протягом інтерфази, називається гетерохроматином (решта хроматину, де в принципі може відбуватися активація транскрипції, позначається як еухроматин). Утворення гетерохроматину здійснюватися, головним чином, у ділянках, що містять повтори – у центромерах, теломерах, зонах концентрації мобільних елементів. Деталі структури гетерохроматину залишаються нез'ясованими, механізми встановлення та підтримання неактивного конденсованого стану гетерохроматину розглядаються в розділі 6.

Петльові домени хроматину та ядерний матрикс

На наступному рівні структурної організації у клітинному ядрі хроматинова фібрила формує петлі, кінці яких є жорстко закріпленими на скелетних структурах клітинного ядра – ядерному матриксі (рис. 4.18). Оскільки основи петлі фіксуються на матриксі, ДНК у складі петлі має топологічні обмеження, тобто є еквівалентною циркулярній (див. розділ 3). Одна петля, що містить від 20 до 200 тис. пар основ ДНК (один або кілька генів), часто розглядається як важливий елемент регуляції процесів транскрипції та реплікації.

Із білками матриксу взаємодіють ділянки ДНК довжиною від 300 до 1 тис. пар основ – ділянки, асоційовані з матриксом (MAR, Matrix Associated Regions). Вони не мають між собою гомології щодо послідовності, часто є збагаченими на АТ-пари. Вважається, що більшість функціональних процесів, які відбуваються на ДНК, розпочинається саме на матриксі, тобто на MAR.

Ядерний матрикс – це система білкових філаментів, яка формує структурний каркас ядра. На периферії ядра розташована особлива частина матриксу, асоційована із внутрішньою ядерною мембраною – ядерна ламіна. Філаменти ламіни протягнуті від однієї ядерної пори до іншої і позиціонують порові комплекси у площині мембрани. Подвійна ядерна мембрана, ядерні пори й ламіна утворюють єдину систему – ядерний конверт. Від ламіни всередину ядра протягнуті філаменти

127

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

внутрішнього ядерного матриксу. З ламіною взаємодіє значна частина гетерохроматину, зокрема центромери та теломери хромосом. Еухроматинова частина хромосоми “звисає” всередину ядра, де хроматинові петлі закріплюються на внутрішній частині матриксу. У результаті хромосома займає певну зону в об'ємі ядра – хромосомну територію.

Петля

хроматинової

фібрили

Рис. 4.18. Схема петльової організації хроматину

Усе, про що йшлося вище, стосується організації хроматину та хромосом в інтерфазному ядрі. Коли клітина вступає в процес мітозу, після реплікації ДНК починається утворення надкомпактної мітотичної хромосоми, деталі структурної організації якої залишаються недостатньо зрозумілими. Одночасно з компактизацією хроматинової фібрили частина ламіни “розчиняється” разом із ядерною мембраною, інша частина, разом із внутрішнім матриксом, перебудовується з утворенням білкового каркасу мітотичної хромосоми – хромосомного скефолду (scaffold), з яким залишаються зв'язаними основи хроматинових петель.

КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ

1.Дайте визначення кодона і відкритої рамки зчитування. Скільки існує кодонів? Які позиції нуклеотидів у складі кодона є найбільш

інайменш визначальними?

2.Що таке ген?

3.Що таке геном? У чому полягає найсуттєвіша відмінність між геномами прота еукаріотів?

4.У чому полягає перекриття генів у вірусів та еукаріотів?

5.Дайте визначення інтрона і екзона.

128

Розділ 4. Організація днк у клітинах: геноми та структура хроматину

6.Яка різниця між кластером генів і опероном?

7.Назвіть основні типи послідовностей ДНК, що повторюються.

8.З яких елементів складається нуклеосома? Яке місце в її структурі належить білкам? Як організована у просторі ДНК у нуклеосомі?

9.Які взаємодії стабілізують нуклеосому? За яким принципом відбувається збирання нуклеосоми?

10.У чому полягає механізм позиціювання нуклеосом відносно послідовності ДНК?

11.Назвіть основні типи посттрансляційних модифікацій гістонів. Які амінокислотні залишки піддаються модифікаціям? В яких частинах молекул гістонів ці залишки розташовані?

12.Як організована хроматинова фібрила у просторі? За яким основним механізмом фібрила піддається компактизації? У чому полягає роль гістону Н1?

13.Що таке ядерний матрикс і яку участь він бере в організації хроматину в клітинному ядрі?

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Akey, C.W., Luger K. Histone chaperones and nucleosome assembly // Curr. Op. Struct. Biol. – 2003. – Vol. 13. – Р. 6–14.

Bednar, J., Horowitz, R.A., Grigoryev, S.A. et al. Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – Vol. 95. – Р. 14173–14178.

Brown T.A. Genomes. – New York ; London: Garland Science, 2002. Chromatin structure and gene expression: frontiers in molecular biology

/eds. S. Elgin, J.L. Workman. – Oxford : Oxford University Press, 2002. Chromatin structure and dynamics: state-of-the-art. New Comprehen-

sive Biochemistry / eds. J. Zlatanova, S.H. Leuba. Amsterdam : Elsevier, 2004. – Vol. 39.

The ENCODE Project Consortium. Identification and analysis of functional elements in 1 % of the human genome by the ENCODE pilot project // Nature. – 2007. – Vol. 447. – 799–816.

Gerstein, M.B., Bruce, C., Rozowsky, J.S. et al. What is a gene, postENCODE? History and updated definition // Genome Res. – 2007.

– Vol. 17. – Р. 669–681.

Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R.D. et al. The nuclear lamina comes of age // Nat. Rev. – 2005. – Vol. 6. – Р. 21–31.

129

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. – 2001. – Vol. 409.

– Р. 860–921.

International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome // Nature. – 2004.

– Vol. 431. –Р. 931–945.

Koonin, E.V. How many genes can make a cell: the minimal-gene-set concept // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. – 2000. – Vol. 1.– Р. 99–116.

Lesk, A.M. Introduction to bioinformatics. – New York : Oxford University Press, 2002.

Luger, K., Richmond, T. J. DNA binding within the nucleosome core // Curr. Op. Struct. Biol. – 1998. – Vol. 8. – Р. 33–40.

Luger, K., Richmond, T.J. The histone tails of the nucleosome // Curr. Opin. Genet. Dev. – 1998. – Vol. 8 – Р. 140–146.

Pearson, H. Genetics: what is a gene? // Nature. – 2006. – Vol. 441.

– Р. 398–401.

Ramakrishnan, V. Histone H1 and chromatin higher-order structure // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. – 1997. – Vol. 7. – Р. 215–230.

Simpson, R.T. Nucleosome positioning: occurrence, mechanisms, and functional consequences // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. – 1991.

– Vol. 40. – Р. 143–184.

Sivolob, A., Prunell, A. Nucleosome conformational flexibility and implications for chromatin dynamics // Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. A.– 2004. – Vol. 362. – Р. 1519–1547.

Strahl, D.D., Allis, C.D. The language of covalent histone modifications // Nature. – 2000. – Vol. 403. – Р. 41–45.

Tremethick, D.J. Higher-order structures of chromatin: the elusive 30 nm fiber // Cell. – 2007. – Vol. 128. – Р. 651–654.

Wu, H.-L., Bagby, S., van den Elsen J.M.H. Evolution of the genetic triplet code via two types of doublet codons // J. Mol. Evol. – 2005.

– Vol. 61. – Р. 54–64.

130

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

За рахунок цього голофермент має змогу ефективно перебирати (шляхом зв'язування та швидкої дисоціації) різноманітні ділянки ДНК, здійснюючи пошук промотора, взаємодія з яким є міцнішою. Отже, субодиниця σ виконує роль загального фактора ініціації транскрипції. Різні промотори розрізняються за спорідненістю до голоферменту (силою промотора). Відповідно, упізнання слабких промоторів залежить від додаткових, специфічних для даного гена чи групи генів, факторів ініціації (див. нижче).

Робочий цикл РНК-полімерази складається з наступних стадій.

•Ініціація транскрипції, яка також є багатостадійним проце-

сом (рис. 5.1):

озв'язування голоферменту з промотором. У результаті формується закритий комплекс, у складі якого ДНК зберігає форму подвійної спіралі;

олокальне плавлення подвійної спіралі з утворенням відкритого комплексу – розходження ланцюгів ДНК, яке дозволяє використовувати один з них як матрицю;

овключення перших двох нуклеотидів до молекули РНК (синтез першого фосфодіефірного зв'язку в активному центрі полімерази) – найповільніша стадія процесу;

озростання первинного короткого транскрипту – приєднання 8–9 нуклеотидів. Після цього є можливою абортивна ініціація (визволення короткого транскрипту), тобто невдала спроба ініціації;

ов іншому випадку відбувається очищення промотора – дисоціація σ-фактора, яка маркує перехід до елонгації транскрипції.

•Елонгація транскрипції, у кожному елементарному акті якої (елонгаційному циклі) відбувається приєднання чергового нуклеотиду до 3'-кінця РНК і пересування кор-ферменту на один нуклеотид уздовж матриці (транслокація).

•Термінація транскрипції при впізнанні полімеразою спеціального сигналу термінації (особливого елемента послідовності), коли відбувається визволення транскрипту. Далі корфермент знову взаємодіє з σ-субодиницею і здійснює новий

пошук промотора.

Суттєвою особливістю прокаріотичної системи транскрипції білкових генів є те, що молекула мРНК зв'язується з рибосомами безпосередньо під час транскрипції – транскрипція мРНК і білковий синтез (розділ 8) є єдиним процесом.

132