3 курс / Фармакология / Диссертация_Яичков_И_И_Разработка_методик_количественного_определения
.pdf71
Рисунок 3.16. Хроматограмма, полученная после ввода раствора МФК в ацетонитриле в концентрации 5 мкг/мл
Таким образом, без использования дериватизации не удалось добиться формиро-
вания хроматографического пика МФК (рис. 3.16). Поэтому были получены триметил-
силил-производные (TMS-производные) данного соединения путём выпаривания 50 мкл его стандартного раствора с концентрацией 5 мкг/мл на вакуумном концентраторе
(60ºС; 3500 об/мин) с последующим добавлением 50 мкл смеси BSTFA и TMCS (99:1,
об./об.) и термостатирования при температуре 60ºС в течении 40 мин. Хроматографиро-
вание осуществлялось в перечисленных выше условиях.
Рисунок 3.17. Хроматограмма TMS-производного МФК
Рисунок 3.18. Масс-спектр TMS-производного МФК
72
При использовании триметилсилилирования был получен хроматографический пик деривата МФК (рис. 3.17). Значение m/z молекулярного иона составило 464, что свидетельствует об образовании ди-TMS-производного МФК (МФК-TMS) (рис. 3.18).
Наиболее интенсивным в спектре является ион со значением m/z 449, который образует-
ся в результате деметилирования метоксигруппы в бензольном кольце (рис. 3.19). По-
этому детектирование в режиме SIM будет производится путём регистрации данного иона.
Рисунок 3.19. Схема фрагментации ди-TMS-производного МФК при ионизации элек-
тронами При выборе температурной программы температура испарителя составила 275 С,
объём вводимой пробы – 1 мкл; режим ввода пробы – без деления потока; скорость по-
тока ПФ - 1 мл/мин; режим детектирования SIM - 449 m/z. Начальная температура тер-
мостата также поддерживалась 100 ºС в течение 3 мин. Уменьшение скорости подъёма температуры до 12,5 ºС/мин приводило к увеличению времени удерживания (tR) с 14,029
мин до 20,475 мин (рис. 3.20), а уменьшение конечной температуры до 250 ºС – ещё к большему увеличению tR до 27,095 мин, а также к значительной потере чувствительно-
сти в 10 раз (рис. 3.21). Таким образом, первоначальная температурная программа явля-
ется наиболее предпочтительной.
73
Рисунок 3.20. Хроматограмма TMS-производного МФК при скорости подъёма темпера-
туры 12,5 ºС/мин и конечной температуре 300 ºС
Рисунок 3.21. Хроматограмма TMS-производного МФК при скорости подъёма темпера-
туры 25 ºС/мин и конечной температуре 250 ºС
В результате подбора температуры испарителя и режима ввода пробы установле-
но, что наиболее высокая чувствительность достигается при 300 ºС и импульсном вводе пробы без деления потока. Время дериватизации в термостате при 60 ºС в течение 20
мин является достаточным, т.к. увеличение продолжительности реакции триметилсили-
лирования не приводило к повышению площади хроматографического пика МФК-TMS (табл. 3.13).
Таблица 3.13
Оптимизация времени дериватизации микофеноловой кислоты
№ |
Время дериватиза- |
|
Площадь хроматографического пика |
||
п/п |
ции, мин. |
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
Ср. знач. |
||
1 |
10 |
38147741 |
39461114 |
38807928 |
38805594 |
2 |
20 |
49014144 |
48511789 |
48782967 |
48769633 |
3 |
30 |
48881189 |
48567291 |
48724540 |
48724340 |
4 |
40 |
48691778 |
49562151 |
49127465 |
49127131 |
5 |
50 |
49256874 |
48954411 |
49105643 |
49105643 |
74
3.1.3.1. Изучение зависимости степени извлечения микофеноловой кислоты из водных растворов от рН среды, природы органического растворителя и времени экстракции
В литературе опубликованы методики количественного определения МФК в био-
логических жидкостях с применением ЖЖЭ для изолирования данного соединения [5 48, 115, 145, 188]. Однако, в данных работах не приводится экспериментальное обосно-
вание используемых условий экстракции, а именно выбора экстрагента, рН среды для перевода аналита в молекулярную форму и времени процесса извлечения.
Для подбора оптимальных условий экстракции к 1 мл фосфатного буферного рас-
твора с рН 2,0; 3,0; 4;0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0 добавляли 50 мкл раствора МФК в концентрации 100 мкг/мл в ацетонитриле (концентрация МФК - 5 мкг/мл), далее добав-
ляли 1 мл органического растворителя, метиленхлорида (МХ), этилацетата или н-
гексана, полученную смесь перемешивали на вортексе в течение 30 сек, а затем центри-
фугировали при 3500 об/мин в течение 5 мин. Затем слой органического растворителя отделяли, переносили в стеклянные виалы объёмом 2 мл и выпаривали на вакуумном концентраторе при 45ºС и 3500 об/мин в течение 15 мин. Сухой остаток реконструиро-
вали 50 мкл смесью BSTFA и TMCS (99:1, об./об.) и дериватизировали. После этого 1
мкл данного раствора вводили в хроматографическую систему. При этом полученные средние значения площадей хроматографических пиков ди-TMS-производного МФК в экстрактах сравнивались с площадью хроматографических пиков данного соединения в концентрации 100 мкг/мл (с учётом 20-кратного концентрирования) в смеси BSTFA и TMCS (99:1, об./об.). Результаты измерений представлены в прил. 3 и на рис. 3.22.
Степень извлечения ,%
100
80
60
40
20
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
рН |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
2.0 |
3.0 |
4.0 |
5.0 |
6.0 |
7.0 |
8.0 |
9.0 |
10.0 |
||||||||||||||||||
|
|
Хлористый метилен |
|
|
|
Этилацетат |
|
|
Гексан |
|
||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 3.22. Изучение влияния природы органического растворителя и рН среды на степень извлечения микофеноловой кислоты
75
Как видно из данных, приведённых в прил. 3 и рис. 3.22, наибольшая степень из-
влечения (СИ) достигается при использовании метиленхлорида при рН 2,0. Резкое уменьшение СИ при смещении рН среды в щелочную сторону связано с переводом мо-
лекулы МФК, которая является органической кислотой, в ионизированную форму, что препятствует её переходу в органическую фазу.
Для выбора оптимального времени экстракции к 1 мл фосфатного буферного раствора (БР) с рН 2,0 добавляли 50 мкл раствора МФК в концентрации 100 мкг/мл в ацетонитриле (концентрация раствора МФК - 5 мкг/мл), далее добавляли 1 мл органиче-
ского растворителя метиленхлорида. Полученная смесь перемешивалась на вортексе в течение 30 сек, 1 мин, 2 мин, 5 мин. Дальнейшая пробоподготовка осуществлялась ана-
логичным образом. Полученные результаты представлены в табл. 3.14.
Таблица 3.14
Влияние времени экстракции на степень извлечения МФК
Время экстракции |
Площадь хроматографического пика |
СИ, % |
|||
1 |
2 |
Ср. знач. |
|||
|
|
||||
30 сек. |
43187990 |
45017361 |
44102676 |
89,77 |
|
1 мин. |
42974510 |
44178122 |
43576316 |
88,70 |
|
2 мин. |
43575217 |
43047855 |
43311536 |
88,16 |
|
5 мин. |
44964782 |
43527727 |
44246255 |
90,06 |
Как видно из данных, приведённых в табл. 3.14, увеличение времени экстракции практически не влияет на СИ. Поэтому перемешивание смеси на вортексе в течение 30
сек является достаточным для максимального извлечения аналита.
3.1.3.2. Подбор условий экстракции микофеноловой кислоты из плазмы
Выбор оптимальных условий для извлечения МФК из плазмы крови производил-
ся на образце с концентрацией аналита 0,05 мкг/мл (НПКО). Для этого к плазме добав-
лялся фосфатный буферный раствор с рН=1,8 (для доведения рН до 2,0) в соотношении
2:1 (плазма/буферный раствор) и определённое количество МХ (табл. 3.15). Получен-
ную смесь перемешивалась на вортексе в течение 30 сек, а затем подвергалась центри-
фугированию при 3500 об/мин в течение 10 мин. Затем слой органического растворите-
ля отделялся и выпаривался в стеклянных виалах объёмом 2 мл на вакуумном концен-
траторе при 45ºС и 3500 об/мин в течение 15 мин. Сухой остаток реконструировался 50
мкл смеси BSTFA и TMCS (99:1) и дериватизировали в термостате. После этого 1 мкл
76
данного раствора вводился в хроматографическую систему и анализировался в указан-
ных выше условиях.
|
|
|
|
|
|
Таблица 3.15 |
||
|
Подбор условий изолирования МФК из плазмы крови |
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
№ |
Объём образца НПКО, |
Объём фосфатно- |
Объём |
S пика ди-TMS-производного МФК |
||||
|
мл |
го БР с рН 1,8, мл |
МХ, мл |
|
|
|
|
|
|
1 |
2 |
|
Ср. знач. |
||||
1 |
0,250 |
0,125 |
1 |
42561 |
43857 |
|
43209 |
|
2 |
0,500 |
0,250 |
1 |
85289 |
89521 |
|
87405 |
|
3 |
1,000 |
0,500 |
1 |
100756 |
105789 |
|
103273 |
|
4 |
1,000 |
0,500 |
2 |
110589 |
112178 |
|
111384 |
|
Как видно из данных, приведённых в табл. 3.15 и рис. 3.23, даже при экстракции из 0,25 мл плазмы 1 мл хлористого метилена удалось достичь достаточной площади хроматографического пика аналита. Данные условия выбраны для дальнейшего иссле-
дования, так как они позволяют минимизировать объём плазмы, необходимой для про-
ведения анализа образцов, полученных от добровольцев, а также приготовления калиб-
ровочных образцов и образцов контроля качества. Кроме того, при изолировании МФК из больших объёмов плазмы концентрация его TMS-производного в экстракте будет значительно выше, что может привести к значительному переносу определяемого веще-
ства из предыдущей пробы.
Рисунок 3.23. Пример хроматограммы ди-TMS-МФК после экстракции из 0,25 мл об-
разца плазмы с концентрацией аналита на уровне 0,05 мкг/мл Таким образом, для проведения пробоподготовки при количественном определе-
нии МФК в плазме методом ГХ/МС были выбраны следующие условия: к 250 мкл плаз-
мы добавлялось 125 мкл фосфатного буферного раствора рН = 1,8 и 1 мл дихлорметана,
полученная смесь перемешивалась на вортексе в течение 30 сек, а затем центрифугиро-
валась при 3500 об/мин. Слой органического растворителя отделяли и переносли в стек-
77
лянные виалы объёмом 2 мл. Экстракт выпаривался на вакуумном концентраторе при
45ºС и 3500 об/мин в течение 15 мин. К сухому остатку добавлялось 50 мкл смеси
BSTFA и TMCS (99:1, об./об.). Дериватизация проводилась в термостате при 60 ºС в те-
чение 20 мин. После этого 1 мкл данного раствора вводили в хроматографическую си-
стему [108].
3.1.3.3. Валидация ГХ-МС-методики определения микофеноловой кислоты в плазме
Аналитический диапазон ГХ-МС-методики определения МФК составил 0,05 - 30,0 мкг/мл. Концентрации калибровочных образцов и образцов контроля качества ис-
пользовались такие же, как и при валидации ВЭЖХ-МС-методики. Результаты валида-
ции методики представлены в табл. 3.16 [108].
А |
Б |
В
Рисунок 3.24. Примеры хроматограмм холостого образца плазмы (А) и образца с кон-
центрацией МФК 0,05 мкг/мл (Б) и 30,00 мкг/мл (В)
78
Таблица 3.16
Результаты валидации ГХ-МС-методики определения микофеноловой кислоты в плазме
Параметр |
|
|
|
|
|
Результат |
|
|
||
Селективность |
|
Хроматографические пики в области времени удерживания определяе- |
||||||||
|
|
|
мого вещества на хроматограммах холостых образцов отсутствовали |
|||||||
|
|
|
(рис. 3.24) |
|
|
|
|
|
|
|
Калибровочная кри- |
Линейная зависимость, полученная с помощью метода наименьших |
|||||||||
вая |
|
квадратов (рис. 3.25, Прил.1, табл. 3): уравнение y= a*x, где: |
|
|||||||
|
|
|
х – концентрация МФК в плазме, мкг/мл; |
|
|
|||||
|
|
|
y – площадь хроматографического пика МФК |
|
|
|||||
|
|
|
а – угловой коэффициент |
|
|
|
|
|||
Концентрация, |
|
0,05 |
|
0,50 |
1,50 |
|
5,00 |
12,50 |
25,00 |
|
мкг/мл |
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Внутрисерийная |
|
1 |
-14,35 |
|
6,82 |
4,02 |
|
6,36 |
6,36 |
5,72 |
правильность |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
-11,72 |
|
3,08 |
1,06 |
|
-0,61 |
-0,22 |
-0,26 |
|
(n=6) |
|
|
|
|||||||
|
3 |
-12,88 |
|
4,06 |
1,84 |
|
-0,51 |
-0,78 |
1,19 |
|
(отн. погр., %) |
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Межсерийная пра- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
вильность (n=18) |
|
-12,98 |
|
4,65 |
2,31 |
|
1,74 |
1,79 |
2,22 |
|
(отн. погр., %) |
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Внутрисерийная |
|
1 |
4,77 |
|
4,97 |
5,58 |
|
2,91 |
5,03 |
3,61 |
прецизионность |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
4,54 |
|
2,75 |
3,42 |
|
4,90 |
5,36 |
5,56 |
|
(n=6) (СV, %) |
|
|
|
|||||||
|
3 |
4,17 |
|
1,95 |
2,17 |
|
3,26 |
3,19 |
4,12 |
|
|
|
|
|
|||||||
Межсерийная преци- |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
зионность (n=18) |
|
4,80 |
|
3,93 |
4,32 |
|
5,08 |
5,80 |
5,27 |
|
(СV, %) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Эффект переноса из |
При вводе холостого образца BSTFA между пробами перенос отсут- |
|||||||||
предыдущей пробы |
|
ствует |
|
|
|
|
|
|
||
Эффект разведения |
|
Образец с концен- |
Среднее значение относительной погрешности = |
|||||||
(n=6) |
|
трацией 50,00 |
1,97; СV = 6,86% |
|
|
|||||
|
|
|
мкг/мл |
|
|
|
|
|
|
|
Эффект матрицы |
|
LQC (0,50 мкг/мл) |
2,28% |
|
|
|
|
|||
(CV MF) |
|
HQC (25,00 мкг/мл) |
2,80% |
|
|
|
|
|||
Степень извлечения |
LQC (0,50 мкг/мл) |
87,85% (CV=2,28%) |
|
|
||||||
(MF) |
|
HQC (25,00 мкг/мл) |
89,53% (CV=2,80%) |
|
|
Площадь хроматографичес кого пика
30000000 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
y = 1119318x |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
R² = 0,9996 |
|
|
|
|
|
|
|||
20000000 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10000000 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Концентрация, мкг/мл |
|
|
|
|
|
Рисунок 3.25. Пример калибровочной кривой при определении МФК методом ГХ-МС
79
В рамках валидации данной методики также изучалась стабильность TMS-
производного МФК при хранении в течение 48 ч в автосемплере (табл. 3.17). Получен-
ные результаты отвечали установленным требованиям.
Таблица 3.17
Результаты оценки стабильности ди-TMS-производного МФК при хранении в автосем-
плере
|
Исходные значения |
Краткосрочная стабильность (48 ч. при ком- |
|
натной температуре) |
|
|
|
|
|
|
|
образцы КК нижнего уровня концентраций – 0,50 мкг/мл |
Сред. знач. (n=6) |
0,534 |
|
0,537 |
SD |
0,027 |
|
0,037 |
CV, % |
4,97 |
|
6,85 |
Концентрация, % от исходного уровня |
106,82 |
|
107,333 |
образцы КК верхнего уровня концентраций – 25,00 мкг/мл |
|
||
|
|
|
|
Сред. знач. (n=6) |
26,430 |
|
26,079 |
SD |
0,954 |
|
1,002 |
CV, % |
3,61 |
|
3,84 |
Концентрация, % от исходного уровня |
105,72 |
|
104,317 |
Таким образом, была впервые разработана и валидирована методика определения МФК в плазме крови методом ГХ-МС. Применение жидкостно-жидкостной экстракции для пробоподготовки, а также дериватизации аналита путём триметилсилилирования позволило достичь сопоставимого с ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС уровня чувствитель-
ности: нижний предел количественного определения МФК составил 0,05 мкг/мл.
3.1.4. Перекрёстная валидация разработанных методик определения микофеноло-
вой кислоты в плазме крови
При проведении перекрёстной валидации в качестве референтной методики была выбрана ВЭЖХ-МС/МС–методика, т.к. в данном случае для расчёта концентраций МФК применяется изотопно-меченный внутренний стандарт МФК-D3. По данным мно-
гочисленных публикаций, а также нормативной документации, данный способ расчёта является наиболее предпочтительным [22, 26, 40, 85, 87, 152].
80
А
Б
В
Рисунок 3.26. Пример SIMхроматограммы (А), TIC-хроматограммы (Б) и масс-спектра
(В) ди-TMS-производного МФК, полученные после анализа образцов плазмы крыс