6 курс / Судебная медицина / Судебно_медицинская_экспертиза_отравлений_антихолинэстеразными_веществами
.pdfрастертых мышц или нервов. Для иллюстрации методики приводим выписку из протокола одного контрольного опыта по определению коэффициента активности холинэстеразы прямой мышцы живота лягушки путем тестиро вания окружающего мышцу раствора на препарате дру гой мышцы лягушки.
П р и м е ч а н и е . |
Ьуквои |
К, обозначены пробы, в которых к |
мышце — тест-объекту |
приливали свежий раствор ацетилхолина ука |
|
занной концентрации. |
Проба |
1 — концентрация ацетилхолина, нахо |
дившегося на протяжении 120 минут в контакте с теми мышцами, холинэстеразная активность которых определялась в этом опыте.
С помощью графической интерполяции (рис. 35) оп ределяем процент разрушения ацетилхолина, а затем вычисляем время полураспада (Т50), а по нему — коэф фициент активности холинэстеразы QChE.
Расчет коэффициента активности холинэстеразы про изводим следующим образом. Время полураспада (Т50) активности холинэстеразы составляет 120 минут, т. е. за это время разрушилось 0,05 мг ацетилхолина (в 10 мл ацетилхолина в разведении 1 • 10 ~5 содержится 0,1 мг ацетилхолина; за 120 минут, т. е. время полураспада, разрушится 0,05 мг ацетилхолина). За 1 час должно раз рушиться X мг ацетилхолина. Следовательно,
246 мг мышцы разрушили 0,025 мг ацетилхолина. 1000 мг мышцы должно разрушить X мг ацетилхолина, откуда
Таким образом, в опы те № 381 коэффициент ак тивности холинэстеразы прямых мышц живота ля гушек составил 0,100 мг/г/час.
В первой серии опытов сравнивалась активность холинэстераз мышц и нер вов контрольных лягушек с активностью мышц и нервов лягушек, находив шихся в течение суток в алкогольном наркозе (в воде, содержащей 0,35 М/л этилового спирта). Ре зультаты приведены в табл. 27 и на рис. 36.
Следовательно, |
при |
|||
алкогольном |
наркозе |
на |
||
блюдается |
угнетение |
ак |
||
тивности |
холинэстеразы |
|||
мышц и нервов |
лягушек, |
|||
определяемая |
|
методом |
||
«неразведенной |
ткани», |
|||
на 30%. |
|
|
|
|
Из табл. |
27 |
видно, |
что в присутствии мышц и нервов, взятых от нарко тизированных животных,
гидролиз |
ацетилхолина |
|
происходил |
в |
1,4 раза |
медленнее, |
чем |
в присут |
ствии тканей контрольных
животных. |
QChE |
состав |
||
ляли соответственно: |
для |
|||
мышц |
0,132 ±0,033 |
и |
||
0,093±0,024 |
и |
0,215± |
||
±0,020 |
и |
0,152 ±0,059. |
Время полураспада составляло при этом обычно около 2 часов. Если не вносить ткани в раствор ацетилхолина, то время полураспада составляет больше 40 часов (табл.28).
Следовательно, мы наблюдали действительно фермен тативный, а не спонтанный гидролиз ацетилхолина.
Важно было выяснить, в какой мере этот гидролиз осуществляется в самом кусочке ткани (или на его по верхности) и в какой мере гидролиз идет за счет холинэстеразы, переходящей из кусочков ткани в раствор, так как действенная концентрация ингибитора может сохра ниться, конечно, только в кусочке ткани, а в растворе ин гибитор разводится в десятки раз. Чтобы выяснить это,
11 Я. С. Смусин |
1G1 |
мы применили прием, ранее использованный А. Г. Гинецинским и 3. И. Барбашовой (1949). Мышцу помещали на 2 часа в стаканчик с 9 мл раствора Рингера при по стоянной аэрации. Затем мышцу вынимали, а к раствору добавляли 1 мл ацетилхолина 1 • 10~4. Ход гидролиза ацетилхолина в этих условиях иллюстрирован в табл. 29. QChE составлял в среднем 0,025 вместо 0,132 в присут ствии мышцы. Следовательно, за счет холинэстеразы, пе решедшей из ткани в раствор, осуществляется не бо
лее чем 22% гидролиза аце тилхолина.
В другой серии опытов мы определяли ход гидроли за ацетилхолина такими же мышцами и нервами после их предварительного расти рания до полной гомогенно сти (результаты приведены в табл. 30). С растертыми тка нями контрольных лягушек мы наблюдали гораздо бо лее быстрый гидролиз, чем с интактными кусочками.
QChE составляли соответст венно для мышц 3,616±0,565 (вместо 0,132±0,033), а для
102
нервов —2,424±0,342 |
(вместо |
0,215 + 0,020). |
С тканями |
наркотизированных лягушек |
мы получили |
практически |
|
те же коэффициенты: |
3,263±0,853 для мышц и 2,846± |
±0,445 для нервов. Таким образом, в этих опытах под твердилась невозможность выявить торможение холинэстераз in vivo обратимыми ингибиторами типа наркоти ков методом растирания тканей. Абсолютные значения QChE, получаемые при растирании тканей, близки к при водимым в литературе (Nachmansohn, 1959).
и* |
163 |
В то же время при работе с интактными кусочками ткани в наших опытах отмечалось значительное тормо жение холинэстераз в тканях наркотизированных жи вотных.
Описанный метод работы с «кусочком неразведенной ткани» для выявления торможения холинэстераз был проведен применительно к другим ингибиторам обрати мого типа (прозерин, морфин и др.).
Полученные результаты свидетельствуют, что для об ратимых ингибиторов холинэстеразы этот метод может быть использован для специальных исследований.
Отравление хинином. В 1940 г. А. П. Николаев вы двинул предположение, что хинин усиливает сократитель ную деятельность матки потому, что он обладает антихолинэстеразным действием и стабилизирует ацетилхолин в организме.
Антихолинэстеразное действие хинина изучалось мно гими авторами, но полученные результаты были весьма противоречивы. В связи с этим мы решили исследовать активность холинэстеразы при отравлении хинином (Я- С. Смусин, 1961). Это представлялось нам тем более интересным, что хинин имеет и судебно-медицинское зна чение, поскольку встречаются смертельные случаи от передозировки хинина, применяемого с целью плодоизг нания.
Кроме обычно применяемого в медицинской прак тике хлоргидрата хинина, мы исследовали также альфайодметилат хинина, синтезированный Г. Т. Татевосяном в 1956 г.
Были установлены средние смертельные дозы, вызы вавшие смерть в течение первых суток при подкожном введении у 50% мышей (ДЛбо)- Эти дозы оказались рав ными для хлоргидрата хинина 0,4 г/кг, а для его альфайодметилата —0,14 г/кг.
Таким образом, при метилировании хинина токсич ность его сильно возросла. Соотношение ДЛБО В весовых единицах составляет для хлоргидрата и йодметилата хи нина соответственно 400 мг/кг и 140 мг/кг. В перерасчете на моли это составит 1,1 миллимоля на 1 кг и 0,3 миллимоля на 1 кг. Следовательно, токсичность хинина возрос ла при его альфа-метилировании в 3,7 раза. Увеличение токсичности многих фармакологических средств при их метилировании известно давно.
164
Нами были проведены опыты по определению актив ности истинной и ложной холинэстераз. Степень активно сти холинэстераз сравнивалась при действии равноэффективных доз обоих веществ (ДЛ50 и 2ДЛ5о). Действие хинина и его йодметилата на активность холинэстеразы in vitro изучалось биологическим методом Платтнера.
Наиболее удобно будет изложить методику на основа нии краткого описания типичного опыта.
Плян опыта:
Первая проба является контрольной: ацетилхолин в ней не разру шился, так как до его прибавления холинэстераза была денатурирована добавлением трихлоруксусной кислоты. Пробы 2 и 3 готовятся так же, как и контрольная проба, однако трихлоруксусная кислота добавля ется после истечения запланированного времени контакта ацетилхолина с холинэстеразой (в нашем случае 60 секунд). Аналогичным образом готовятся пробы 4 и 5, но в отличие от проб 2 и 3, кроме хо линэстеразы и ацетилхолина, в растворе во время контакта присутст вует еще ингибитор — хинин. Соответственно мы уменьшали коли чество дистиллированной воды с тем, чтобы объем жидкости во всех пробах был одинаковым.
В разбираемом случае оказалось, что в контрольной пробе (про ба 1) уменьшение концентрации ацетилхолина вдвое ведет к соответ ствующему снижению высоты сокращения мышцы (с 80 до 46 мм).
Теперь переходим к оценке полученных результатов методом гра фической интерполяции. В пробах 2 и 3 мышца сократилась в сред нем до 46 мм, а в пробах 4 и 5 — до 63 мм. Это соответствует разру шению ацетилхолина на 50 и 25%. После этого мы определяем Т5о холинэстеразы, т. е. время, необходимое для того, чтобы исходная концентрация ацетилхолина в результате ферментативного гидролиза снизилась вдвое. В данном случае Т50 составляет 120 секунд. Таким
165
образом, холинэстераза оказалась угнетенной на 50% (время полу распада ацетилхолина после добавления хинина оказалось вдвое больше). Исходная концентрация хинина, вызвавшая такое угнете ние, была равна 4-Ю- >но в момент экспозиции (вследствие добавле ния других компонентов смеси) эта концентрация была в 4 раза ни же, т. е. составляла 1 • Ю - 5 . Следовательно, хинин в концентрации 1 • 10 угнетает холинэстеразу сыворотки лошади на 50%.
Однако в очень редких случаях удается сразу устано вить концентрацию вещества, угнетающую холинэстера зу на 50%. Как правило, при работе мы сталкивались с серией концентраций, угнетающих холинэстеразу, на пример, на 20%, 40%, 50% и т. д. Для того чтобы точно подобрать концентрацию вещества, угнетающую холин эстеразу именно на 50%, можно опять-таки воспользо ваться графической интерполяцией, с помощью которой удается в первом приближении установить, какая кон центрация исследуемого вещества угнетает холинэстеразу вдвое. Графическая интерполяция проводится в прямо угольной системе координат. По оси ординат отклады ваем проценты угнетения холинэстеразы, по оси абс цисс— концентрацию ингибитора. Могут быть отложены как абсолютные значения концентрации, приведенные к одной степени разведения (например, от 0,1 до 16 • Ю- 8 ), так и характеристики отрицательных логарифмов этих величин.
Соединяем прямой линией две точки, характеризую щие угнетение холинэстеразы ингибитором на величину, большую и меньшую 50%. Эта линия, естественно, пере сечет горизонталь, соответствующую половинному угне тению холинэстеразы. Опустив из точки пересечения пер пендикуляр, получаем на оси абсцисс цифровое значение искомой концентрации или характеристику его отрица тельного логарифма (рис. 37,а).
На рис. 37 приведено вычисление концентрации ин гибитора, угнетающей холинэстеразу на 50%. По гори зонтали — концентрация ингибитора в абсолютных зна чениях, приведенных к общему знаменателю (все кон центрации даны применительно к концентрации 1 • Ю - 8 ) . Допустим, что вещество в концентрации 10 • 10~8 (1 • Ю- 7 ) угнетает холинэстеразу на 80%, а концентрация 5- Ю- 8 — на 40%'. Находим соответствующие точки на графике и соединяем их между собой. Опустив перпендикуляр на ось абсцисс из точки пересечения проведенной нами лй-
1G6
нии с горизонталью, соответствующей 50% угнетению эн зима, получаем, что исследуемое вещество будет тормо зить холинэстеразу на 50% в концентрации 6,4 • 10~8 (рис. 37,6).
Когда мы берем две точки, характеризующие угне тение холинэстеразы меньше или больше, чем на 50%,
то в идеальных условиях соединяющая их линия не мо жет быть прямой. Особенно это вырисовывается, если бе рут точки, далеко отстоящие друг от друга (например, угнетение холинэстеразы на 20 и 80%). Получаемые экс периментальным путем промежуточные точки приводят к заключению, что в таких условиях линия, проведенная
167
через них, имеет ~ образный характер. Однако, как пра вило, в зоне 50% ингибирования холинэстеразы эта ли ния приближается к прямой. Поэтому в целях получения наиболее точных результатов мы высчитывали методом графической интерполяции концентрацию, угнетающую холинэстеразу на 50%, из двух точек, максимально при ближенных к такой степени угнетения: например, 40 и 60% ингибирования холинэстеразы.
Повторные определения концентрации, снижающие вдвое активность холинэстеразы, производились с вновь приготовленными растворами препаратов. Во всех слу чаях концентрация вещества, угнетающая холинэстеразу на 50%, определяемая этим методом, от опыта к опыту оставалась практически стабильной. Высчитанная кон центрация, угнетающая активность холинэстеразы на 50%, проверялась в прямом опыте. Во всех случаях бы ло получено совпадение расчетных и экспериментальных данных с точностью ± 5 % .
Концентрации хинина, угнетающие холинэстеразу на 50%, первоначально найденные биологическим методом Платтнера, были проверены Н. К- Фруентовым в лабо ратории, руководимой М. Я- Михельсоном, методом Хестрина на фотоэлектроколориметре. Полученные данные оказались тождественными.
Для биохимического исследования активности холин эстеразы крови быка in vitro был использован метод оп ределения холинэстеразы по Хестрину.
Кроме того, в опытах in vitro исследовали влияние хинина и его йодметилата на активность ложной холин эстеразы индикаторным методом. Для этой цели к 1 мл
сыворотки лошади в разведении 1:12,4 |
(на растворе Рин- |
||
гера) добавляли 0,5 мл хинина |
или его |
йодметилата |
|
в разведении 2-10- 3 —1,6-Ю- 5 , |
1 |
мл |
ацетилхолина |
1 • 10~2 М и 0,1 мл индикатора. В качестве индикатора был использован 0,025% раствор фенолрота в фосфатном буфере (рН = 7,8). Исследования производились на ФЭК-М с использованием зеленого светофильтра (полоса поглощения 550 mu.) и кюветы 5,050 мм.
В опытах in vitro методами Платтнера и Хестрина не удалось отметить угнетения активности холинэстеразы мозга и мышц белых мышей и крови быка при действии хлоргидрата хинина и его йодметилата даже в концен трации 2- Ю- 4 . Увеличивать концентрацию мы не сочли