5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Бронхиальная_астма_В_2_томах_Том_1_Чучалин_А_Г_1997
.pdfЛИТЕРАТУРА
Черняев АЛ, Жаворонков АА. Патоморфологическая и морфометрическая диагностика бронхоспастического синдрома при хроническом диффузном бронхите и бронхиальной астме. Арх патол 1981; 3:60-6.
Beasley R, Roshe WR, Roberts JA et al. Cellular events in the bronchi in mild asthma and after bronchial provocation. Am Rev Respir Dis 1989; 139:806-17.
Busse WW, Calhoun WF, Sedgwick JD. Mechanism of airway inflammation in asthma. Am Rev Respir Dis 1993; 147:S20-S24.
Chuchalin AG, Grobova OM, Chemiaev AL et al. The delayed Respiratory Consequences of inhaled Radionuclides in population exposed to nuclear catastrophe. Stem cells 1995; 13(Suppl 1:276-83).
Djukanovic R, Wilson RW, Lai CKW et al. The safety aspects of fiberoptic bronchoscopy, bronchoalveolar lavage, and endobronchial biopsy in asthma. Am Rev Respir Dis 1991; 143:772-7.
DunnilMS. Palmonary pathology. Churchill Livingstone: Edinburgh, 1982:50-60.
European Society of Pneumology Task Group on BAL. Technical recomendation and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL). Eur Resp J 1989; 2:561-85.
Fabbri LM, Maestrelli P, Saetta M et al. Airway inflammation during late asthmatic reactions induced by toluene diisocyanate. Am Rev Respir Dis 1991; 143(Suppl:37-8).
Hunt LW, Mansfield ES, Sur Set al. Late neutrophilic response to bronchial allergen challenge: A response to endotoxin? J Allergy Clin Immunol 1992; 89: 335.
Laitinen A. Epithelial damage in glucocorticoids and mechanism of asthma. Excerpta Medica: Amsterdam 1989: 215-229.
Laitinen A. Ultrastructural organization ofintraepithelial nerves in the human airway tract. Thorax 1985; 40:488-92.
Laitinen LA, Heino M, Laitinen A et al. Damage ofthe airway epithelium and bronchial reactivity in patients with asthma. Am Rev Respir Dis 1985; 131:599-606.
Laitinen LA, Laitinen A. Mucosal inflammation and bronchial hyperreactivity. Eur Respir J 1988; 1:488-89.
Laitinen LA, Robinson NP, Laitinen A, Widdicombe JG. Relationship between mucosal thickness and vascular resistance in dogs. J Appl Physiol 1986; 61:2186-93.
Laitinen LA, Robinson NP, Widdicombe JG. Effects of inflammatory and other mediators on airway vascular beds. Am Rev Respir Dis 1987; 67-70.
Lee TN. Mechanism of aspirin sensitivity. Am Rev Respir Dis 1992; 145 (Suppl:34-6).
Lundgren R, Soderberg M, Horstedt P, Stenling R. Morphological studies of bronchial mucosal biopsies from asthmatics before and after ten years of treatment with inhaled steroids. Eur Respir J 1988; 1:883-89.
Mengelers HJ, Maikoe T, Brinkman L et al. Immunophenotyping of eosinophils recoved from blood and BAL of Allergic Asthmatics. Am Rev Respir Dis 1994; 149:345-51.
National Institutes of Health. Workshop summary and guidelines: Investigative use of bronchoscopy, lavage, and bronchial biopsies in asthma and other airway diseases. J Allergy Clin Immunol 1991; 88:808-14.
Robinson DS, Hamid Q, Ying S et al. Predominant Th2-like bronchoalveolar T-lymphocytes population in atopic asthma. N Engl Med 1992; 326:298-304.
Robuschi M, Riva E, Fuccella LM et al. Prevention of exercise-induced bronchoconstriction by a new leukotriene antagonist (SK&F 104353). Am Rev Respir Dis 1992; 145:1285-8.
Smith DL & Deshazo RD. Bronchoalveolar lavage in asthma: an update and perspective. Am Rev Respie Dis 1993, 148:523-32.
50
Soderberg M, Hellstrom S, Sandstrom S et al. Structural characterization of bronchial mucosal biopsies from healthy volunteers: a light and electron microscopical study. Eur Respir J 1990; 3:261-
66.
The BAL Cooperative Group Steering Commity. Bronchoalveolar lavage constituents in healthy individuals, idiopatic pulmonary fibrosis, and selected comparison groups. Am Rev Respir Dis 1990: 141(5 Part 2:S169-202).
van Vyve T, ChanezP, Bousquet J et al. Safety of bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies in patients with asthma of variable severity. Am Rev Respir Dis 1992; 146:116-21.
WardlawA3, Dunnette S, Gleich GJet al. Eosinophils and mast cells in bronchoalveolar lavage in subjects with mild asthma. Am Rev Respir Dis 1988:137:62-9.
51
С.Н. Орлов, И.А. Баранова Н.И. Покудин
Гладкомышечныеклетки: внутриклеточныесистемы сигнализациии патология легких
Впоследние десять-пятнадцать лет достигнут существенный прогресс
ввыяснении молекулярных механизмов функционирования сигнальных систем клетки, т.е. систем, ответственных за восприятие и проведение гор мональных и электрических сигналов от рецепторов на белки-исполните ли. Эти системы выполняют ключевую роль в координации работы мно гоклеточных ансамблей, в том числе такого сложно устроенного органа, каким являются легкие. Неудивительно, что даже небольшие (генетичес ки детерминированные или приобретенные благодаря воздействию внеш них неблагоприятных факторов) изменения компонентов сигнальных си стем приводят к развитию патологических состояний. Эти же системы рас сматриваются как основные и наиболее эффективные мишени при разра ботке новых фармакологических препаратов. В этой главе мы постараем ся суммировать данные о молекулярно-биологической природе патогене за и терапии некоторых заболеваний легких, затрагивающих сигнальные системы гладкомышечных клеток воздухопроводящих путей (ГМК ВП).
Вобзоре мы не рассматриваем сигнальные системы, активируемые ре цепторами, ковалентно связанными с киназами тирозинового типа и гуанилатциклазой. В большинстве случаев первые события разворачиваются на уровне плазматической мембраны, где локализованы рецепторы ней ромедиаторов и пептидных гормонов (R,). Активированные рецепторы взаимодействуют с ГТФ-связывающими белками (Gp), которые передают информацию на мембранные белки-мишени (Т,). В ограниченном числе
52
случаев (постсинаптические Na-каналы, потенциалоперируемые ионные каналы) рецептор (в данном случае n-холинорецептор и сенсор мембран ного потенциала, соответственно) локализован на молекуле Тр и сигнал передается без участия Gp. Активированный Т, контролирует внутрикле точную концентрацию вторичных посредников (М), которые в свою оче редь модифицируют активность цитоплазматических белков-мишеней (Т2). Последние контролируют функциональную активность, воздействуя на белки-исполнители. Ряд соединений (стероидные и тиреоидные гор моны) свободно проникают через цитоплазматическую мембрану, взаи модействуют с цитоплазматическими рецепторами (R2), которые попадая в ядро, изменяют экспрессию белков, в том числе и тех, которые образуют сигнальную систему. Рецепторы R, типа, взаимодействующие с ГТФ-свя- зывающими белками, относятся к суперсемейству белков, уникальным свойством которых является наличие семи а-спиралей, пронизывающих мембрану, и набора участков для потенциального фосфорилирования, ло кализованных на С-конце, обращенном в цитоплазму. Установлено, что один такой рецептор может активировать 10—1000 молекул Gp. Такой же коэффициент усиления сигнала существует и на остальных этапах прове дения сигнала (Gp -» Тр Т, —»М, М —>Т2), обеспечивая таким образом колоссальный коэффициент усиления 106-1 0 12, что не уступает, а зачас тую и превосходит коэффициенты усиления современных систем приема радио- и телесигналов. Продолжая эту аналогию, необходимо отметить, что другим достоинством клеточной сигнализации является ее избиратель ность, то есть крайне низкое отношение сигнал/шум, на фоне которого ей приходится работать. Высокая селективность клеточного ответа при акти вации сигнальных систем определяется следующими факторами:
1.Вариабельностью и стереоспецифичностью рецепторов для целого ряда химических, электрохимических, световых и тепловых стимулов. Так, только для нейромедиаторов их число достигает тридцати. Более того, одни
ите же нейромедиаторы могут взаимодействовать с разными рецептора ми, и набор этих рецепторов тканеспецифичен. Так, например, к настоя щему времени известно около 10 типов рецепторов катехоламинов и 5 ти пов рецепторов ацетилхолина.
2.Большим набором Gp, состоящих из трех субъединиц (а, Р, у). К на стоящему времени известно около 20 а-субъединиц и 4 типа р и у-субъе- диниц, что увеличивает общее число комбинаций приблизительно до 300.
3.Разнообразием мишеней Тр локализованных на плазматической мем бране. Например, ионные каналы различаются по селективности, прово димости, чувствительности к изменениям мембранного потенциала и вза имодействию с Gp. Ферменты, регулируемые Gp, имеют большое число изо
53
форм, отличающихся по механизму регуляции их активности (аденилатциклаза - 6, фосфолипаза С - 5 изоформ, фосфолипаза А2 - 6).
4. Наличием нескольких вторичных посредников, среди которых наи более полно изучены циклические нуклеотиды (cAMP, cGMP), продукты гидролиза фосфолипидов (инозитолфосфаты и диацилглицерол) и каль ций. Кроме того, в последнее время функции вторичных посредников при писываются полифосфоинозитидам (PIP и Р1Р2), лизофосфатидной кис лоте, продукту гидролиза сфингомиелина, керамиду и др. В ряде случаев вторичные посредники диффундируют из клетки и воздействуют на спе цифические рецепторы, локализованные на этой же или соседних клет ках (так называемые короткодистантные гормоны, например, простагландины и лейкотриены, образующиеся при активации фосфолипазы А^). Этот механизм, а также другие пути передачи сигнала образуют сложную тка неспецифичную систему обратных связей, обеспечивающую согласован ную работу (cross-talking) сигнальных систем.
В следующих разделах будут рассмотрены специфические особенности сигнальных систем на примере клеток гладкой мускулатуры воздухопро водящих путей.
Основным триггером сокращения гладкомышечных клеток (Harsthome, 1992) является прирост концентрации ионизированного кальция Са2+Г Этот прирост обеспечивается как за счет спонтанной электрической активнос ти клеток, открытия потенциалуправляемых каналов и входа Са2+ из вне клеточного пространства, так и за счет высвобождения кальция из саркоплазматического ретикулума (SR). В ГМК ВП последний путь повыше ния внутриклеточной концентрации кальция доминирует (Bourreau, 1993). В данном случае сигналом к этому является высвобождение инозитолтрифосфата (1Р3) при гидролизе трифосфоинозитидов (Р1Р2) специфической фосфолипазой С (PLC). В свою очередь PLC связана с целым спектром рецепторов R, типа (в данном случае приведен М-холинорецептор). Вболь шинстве случаев эта связь опосредована через Gi или неидентифицированные ГТФ-связывающие белки (Gp). Согласно последним данным, 1Р3 фосфорилируется СаМ-зависимой протеинкиназой до инозитол 1,3,4,5- тетрафосфата (1Р4), и это соединение может приводить к открытию рецепторуправляемых Са2+-каналов плазматической мембраны. При увеличе нии Са2+ в диапазоне от 10'7 до 10'6 происходит его связывание с универ сальным цитоплазматическим регулятором —кальмодулином (СаМ) и ак тивация киназы легких цепей миозина (MLCK). Именно этот фермент, осуществляя фосфорилирование миозина (М), инициирует его взаимодей ствие с актином (А) и сокращение ГМК. Другой продукт гидролиза Р1Р2 фосфолипазой С диацилглицерол является мощным активатором проте-
54
инкиназы С. Механизм вовлечения этого фермента в регуляцию сокраще ния ГМК до сих пор не установлен.
Нарушение контроля цитозольной концентрации кальция, приводящее к повышенной контрактильности гладкомышечных клеток, выявлено при ряде заболеваний, в том числе и при бронхиальной астме. Патология об мена Са2+ вследствие изменения рецепторного аппарата, регуляторных белков приводит к гиперреактивности и клеточному росту (Sakai, 1993).
С теоретической точки зрения могут быть выделены следующие пути контроля гомеостаза кальция в ГМК ВП при бронхиальной астме:
—для предотвращения сокращения с целью профилактики приступа воз можно использование антагонистов рецепторов, ингибиторов входа вне клеточного кальция и его высвобождения из саркоплазматического ретикулума, антагонистов кальмодулина и контрактильных белков;
- для снятия усиленного контрактильного ответа при симптоматичес ком лечении астмы могут быть ингибированы вход кальция, инозитолтрифосфатный метаболизм, протеинкиназа С, усилен механизм выхода кальция за счет функционирования Са2+-АТФазы и Ыа+/Са2+-обменника сарколеммы и Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума.
Приведенная здесь схема объясняет механизм действия основных клас сов лекарственных препаратов, используемых в качестве бронхолитиков или рассматриваемых как потенциально перспективные в этом плане со единения. Это особенно важно в терапии бронхообструктивных заболева ний, и прежде всего бронхиальной астмы. Антагонисты М-холинорецеп- торов блокируют действие ацетилхолина на фосфолипазу С, снижая тем самым уровень фосфоинозитидного ответа и прироста внутриклеточной концентрации кальция. В экспериментах in vitro на ГМ ВП морской свин ки показана эффективность ингибитора фосфолипазы С (U-73122) для снятия сокращения, вызванного антигеном, агонистами мускариновых рецепторов и лейкотриенами (Salari, 1993). Агонисты Р-рецепторов (р) вызывают активацию аденилатциклазы (АС) через выбелок и прирост сАМР. Этот вторичный посредник в свою очередь активирует протеинкиназу A (Prk-A), которая фосфорилирует MLCK, уменьшает ее сродство к комплексу Са4...СаМ. Предполагается также, что протеинкиназа A (Prk- А), фосфорилируя специфический белок фосфоламбан, увеличивает ак тивность Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума. Ингибиторы фосфодиэстеразы (PDE) препятствуют быстрому падению уровня сАМР в клетке. Антагонисты кальмодулина препятствуют образованию активной конформации комплекса Са2+ через потенциалуправляемые кальциевые каналы.
55
Слабым местом такого рода схем является то обтоятельство, что они по строены, как правило, на основании синтеза данных, полученныхдля раз ного типа клеток. Так, например, данные о модификации активности MLCK протеинкиназой А в наиболее полной мере разработаны только для гладкой мускулатуры желудка птиц. Сведения об участии протеинкиназы А в регуляции активности Са2+-насоса саркоплазматического ретикулума получены на кардиомиоцитах. Данные о кинетических характеристиках формирования фосфоинозитидного ответа ГМК ВП ограничены единич ными сообщениями. Это замечание особенно существенно при анализе путей фармакологической коррекции активности ГМК, характеризующих ся крайне высокой тканевой и видовой специфичностью. Следует особо отметить, что именно знание особенностей принципов функционирова ния клеток специализированной ткани позволяет создать тропные к ней фармакологические препараты, обладающие минимумом побочных дей ствий. Поясним это на примере прогресса, достигнутого в последние годы при выяснении механизма действия имеющихся бронхолитиков и созда ния новых лекарственных препаратов.
ГМК ВП большинства млекопитающих, в том числе и человека - из распространенных экспериментальных животных исключение составля ет морская свинка - лишены спонтанной электрической активности и ос цилляций мембранного потенциала, вызванного распространением потен циала действия. Это означает, что, несмотря на существование в ГМК ВП медленных (L-типа) потенциалуправляемых Са2+-каналов (это положение подтверждено в экспериментах по связыванию меченых Са2+-антагонис- тов), такие каналы не будут вносить существенного вклада в общую вели чину входящего потока кальция за счет сохранения мембранного потен циала на уровне, обеспечивающем поддержание этих каналов в закрытом состоянии. Кроме того, известно,что сродство Са2+-каналов L-типа к каль циевым антагонистам (производные дигидропиридинов и фентоламинов) при нормальных значениях мембранного потенциала относительно неве лико и резко возрастает в условиях деполяризации. По всей видимости, именно этим и объясняется тот факт, что в отличие от патологий сердеч- но-сосудистой системы и, в частности, гипертонической болезни, орга нические антагонисты кальция (производные верапамила, дилтиазема и дигидропиридинов) не получили широкого распространения в терапии бронхиальной астмы (Barnes, 1992).
В этой связи особое внимание привлекают исследования, посвящен ные механизмам регуляции потенциала сарколеммы ГМК ВП. Имеющи еся данные свидетельствуют о том, что решающая роль в этом процессе принадлежит высокой калиевой проводимости. Так, было обнаружено, что
56
антагонисты К+-каналов (харибдотоксин, ибериотоксин, тетраэтиламмоний) вызывают деполяризацию, которая в свою очередь активирует потенциалуправляемые Са2+-каналы. Вход кальция через них в дополнение к выбросу кальция из внутриклеточных депо приводит к поддержанию внутриклеточной концентрации кальция на высоком уровне и сокраще нию ГМК ВП (Morthan, 1989).
ВГМК ВП обнаружено три типа К+-каналов:
1)потенциалуправляемые К+-каналы (Kotlikoff,1993),
2)К+-каналы, активируемые при повышении концентрации внутрикле точного кальция: малой проводимости (ингибируются апамином), сред ней и большой проводимости (ингибируются харибдотоксином — ChTX, ибериотоксином) (Yamauchi, 1994),
3)К+-каналы, время нахождения которых в открытом состоянии резко возрастает при падении внутриклеточной концентрации АТФ, ингибиру ются глибенкламидом (glibenclamide) и активируются никорандилом (nicorandil), кромокалимом (cromocalim), пинацидилом (pinacidil) и апикалимом (apicalim или соединение RP 52891) (Escande,1992).
Основную роль среди этих функционально различных К+-каналов иг рают Са2+-зависимые каналы большой проводимости. Их ингибирование вызывает сокращение ГМК ВП. В настоящее время известно также, что эти каналы вовлечены в регуляцию тонуса ГМ ВП при действии р-агони- стов и М-холинолитиков.
Следующие данные свидетельствуют о том, что действие Р-рецепторов
исистемы сАМР связано с активностью Са2+-зависимых К+-каналов боль шой проводимости, содержание которых в ГМК ВП наиболее велико.
Действие Р-агонистов, каталитической субъединицей протеинкиназы А и Gs на К+-проводимость наблюдалось только при наличии в растворе, омывающем внутреннюю поверхность мембраны микромолярных концен траций Са2+ (Ките, 1992).
Расслабляющее действие умеренных концентрации Р-агонистов на то нус ГМК ВП морской свинки и человека, предварительно обработанных ацетилхолином, уменьшалось в присутствии ChTX, но не ингибиторов АТФ-чувствительных К+-каналов или апамина (ингибитора Са2+-активи- руемых К+-каналов малой проводимости (Miura, 1992).
Вэтих же работах установлено, что ингибирующий эффект ChTX осла бевал по мере увеличения концентрации Р-агониста, был относительно не велик при использовании ингибиторов фосфодиэстеразы и не был отме чен, когда расслабление ГМК осуществлялось за счет введения активато ра АТФ-чувствительных К+-каналов. На основании этих данных можно заключить, что в ГМК ВП расслабляющее действие агонистов Р-рецепто-
57
ров опосредовано через открытие К+-каналов и гиперполяризацию сар колеммы, что приводит к снижению поступления кальция как через ион ные каналы, так и через систему электрогенного С а 2+/ № +-о б м е н а . в от личие от ГМК ВП, в ГМК сосудов расслабляющий эффект сАМР-сигналь- ной системы опосредован через прямое ингибирующее действие этого посредника на Са2+-каналы L-типа (Orlov, Tremblay, Hamet, данные подго тавливаются к публикации), что создает предпосылки для создания тка неспецифичных лекарственных препаратов.
Таблица 1
Влияние изопреналина, каталитической субъединицы протеинкиназы А и окадевой кислоты на кинетические характеристики К+-каналов гладкой мускулатуры трахеи кролика (Ките, 1989)
Соединение |
Вероятность нахождения |
|
канала в открытом состоянии |
||
|
||
Контроль |
0,012±0,004 |
|
Изопреналин |
0,08±0,02 |
|
Изопреналин+окадевая кислота (10~5М) |
0,19±0,08 |
|
Протеинкиназа А —10 Ед/мл |
0,033±0,006 |
|
(каталитическая субъединица) |
||
|
Протеинкиназа А (10 Ед/мл) + |
0,23±0,05 |
|
окадевая кислота (lO^M) |
||
|
Вэкспериментах по регистрации одиночной проводимости каналов
*было установлено, что (i-агонисты увеличивают вероятность нахождения К+-каналов в открытом состоянии. Этот эффект модулировался добавле нием каталитической субъединицы протеинкиназы А и ингибитора фосфопротеинфосфатаз - окадевой кислоты (табл.1). Позднее было установ лено, что увеличение К+-проводимости наблюдается после добавления не гидролизуемых аналогов ГТФ, которые потенцируют действие Р-агонис- тов, что указывало на участие в этом процессе ГТФ-связывающих белков.
Всамом деле, открытие К+-каналов наблюдалось при добавлении Gs или его субъединицы в комплексе с ГТФ, но не ГДФ (Ките, 1992). В настоя щее время установлено, что гиперполяризующее действие агонистов Р- рецепторов может осуществляться по двум независимым друг от друга пу тям, связанным как с активацией аденилатциклазы, протеинкиназы А и фосфорилированием неидентифицированного белка или, возможно, не посредственно каналоформера, так и с непосредственным стимулирую-
58
щим действием а-субъединицы выбелка на К+-каналы, так называемый “membrane-limited” механизм (Ките, 1994).
Высвобождение ацетилхолина из нервных окончаний парасимпатичес кой нервной системы играет центральную роль в сокращении гладкомы шечных клеток, в том числе и ВП. Тем не менее, как уже отмечалось выше, последовательность событий, приводящих к сокращению ГМ ВП при ак тивации М-холинорецепторов, до сих пор не установлена
Было выявлено, что ацетилхолин, действуя через М-холинорецептор, уменьшает время нахождения Са2+-активируемых К+-каналов в открытом состоянии. Действие агониста М-холинорецепторов усиливалось в при сутствии ГТФ и блокировалось ГДФ, а также коклюшным токсином (Ките, 1992). Известно, что при действии коклюшного токсина происходит АДФрибозилирование целого семейства G-белков, отличающихся своей а - субъединицей (так называемые G^, Gm и Gat ГТФ-связывающие белки). Тем не менее ни а , ни а о субъединицы не вызывают ингибирования Са2+- активируемых К+-каналов ГМК ВП (Ките, 1992). Трудно предположить, что в этот процесс вовлечена a t субъединица, до сих пор обнаруживаемая только в наружных сегментах палочек сетчатки. В этой связи можно пред положить, что действие М-холинолитиков на Са2+-активируемые К+-ка- налы либо опосредовано через новый класс a -субъединиц, чувствитель ных к коклюшному токсину, либо в этом взаимодействии участвуют также Р~ и у-субъединицы.
Приведенные здесь сведения позволяют предположить следующую схе му регуляции Са2+-зависимых К+-каналов при действии агонистов р-ад- рено- и М-холинорецепторов. Агонисты М-холинорецепторов приводят к высвобождению кальция из внутриклеточных депо и входу кальция че рез рецептороперируемые каналы, открываемые либо в ответ на повыше ние Са2+., либо за счет продукции 1Р4. Открытие низкоселективных рецептороперируемых Са2+-каналов стремится вызвать деполяризацию мемб раны. Деполяризация мембраны препятствует выходу калия через кана лы, открывающиеся в ответ на повышение [Са2+],. Сравнительно недавно это было убедительно продемонстрировано нами в экспериментах на эри троцитах человека и полосках гладкой мускулатуры мочеточника, где транзиторный гиперполяризационный ответ также связан с активацией К+- каналов (Баскаков, 1989). Как уже отмечалось выше, сарколемма ГМК ВП обогащена высокопроводящими Са2+-активируемыми К+-каналами, бло кируемыми ChTX, которые препятствуют деполяризации мембраны и вхо ду кальция через рецепторуправляемые каналы, блокируемые органичес кими антагонистами кальция. Тем не менее такая возможность, по-види
59