6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов
.pdfчерным гало (S. paratyphi A, S. cho-leraesuis, S. abortusovis, S. gallinarum-pullorum образуют светлые зеленоватые колонии), среда под колониями также окрашена в черный цвет. Следует помнить, что компоненты висмут-сульфитного агара ингибируют рост возбудителябрюшноготифа.Сальмонеллымогутформировать также переходные и шероховатые тусклые и сухие R-колонии с неровными краями.
Сальмонеллы отличаются от E. coli меньшей ферментативной активностью. При ферментации глюкозы и ряда других углеводов образуют кислоту и газ (за исключением S. typhi и некоторых других серотипов), обладают лизин- и орнитиндекарбоксилазами, не имеют фенилаланиндезаминазы, растут на голодном агаре с цитратом (кроме S. typhi), не фер-
ментируют лактозу (кроме S. arizonae, S. diarizonae),
не образуют индола, не имеют уреазы, дают отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра.
Антигены. Сальмонеллы содержат О- (соматиче - ские), Н- (жгутиковые) и некоторые - К- (капсульный) антигены. Н-антигены могут существовать в двух разных фазах: специфической 1-й фазе и менее специфической, или групповой, 2-й фазе. Анализ антигенного строения является обязательным элементом микробиологической диагностики сальмонеллезов и проводится по схеме Ф. Кауфмана и П. Уайта, в основу которой положена общность О-антигена сальмонелл, объединенных в серологические группы: A, B, C, D, E, F и т.д. Всего известно около 65 серогрупп, в которых О-антигены обозначены цифрами. В сокращенном варианте эта схема представлена в таблице 11.
207
Таблица 11 Классификация сальмонелл по антигенной структуре
(в сокращенном варианте)
Серогруппа, вид или серовар |
О-антиген |
Н-антиген |
||
фаза 1 |
фаза 2 |
|||
|
|
|||
1 |
2 |
3 |
4 |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Серогруппа А |
|
|
|
|
S. paratyphi A |
1,2,12 |
a |
(1,5) |
|
Серогруппа В |
|
|
|
|
S. schottmuelleri |
1,4, (5), 12 |
b |
1,2 |
|
S. abony |
1,4, (5), 12 |
b |
e,n,x |
|
S. typhimurium |
1,4, (5), 12 |
i |
1,2 |
|
S. derby |
1,4, (5), 12 |
f,g |
(1,2) |
|
S. wien |
1,4,12,27 |
b |
1,w |
|
S. haifa |
1,4, (5), 12 |
z |
1,2 |
|
S. heidelberg |
1,4, (5), 12 |
r |
1,2 |
|
Серогруппа С |
|
|
|
|
S. hirschfeldii (S. paratyphi C) |
6,7,(Vi) |
c |
1,5 |
|
S. choleraesuis |
6,7 |
c |
1,5 |
|
S. montevideo |
6,7 |
m,s,(p) |
- |
|
S. leopoldville |
6,7 |
b |
1,5 |
|
S. bonn |
6,7 |
1,v |
- |
|
Серогруппа D |
|
|
|
|
S. typhi |
9,12 |
d |
- |
|
S. enteritidis |
1,9,12 |
g,m |
(1,7) |
|
S. dublin |
1,9,12 |
g,p |
- |
|
S. rostock |
1,9,12 |
g,p,u |
- |
|
S. moscow |
9,12 |
b,g |
- |
|
S. gallinarum |
1,9,12 |
s,q |
- |
|
Серогруппа E |
|
|
|
|
S. london |
3,10 |
l,v |
1,6 |
|
S. anatum |
3,10 |
e,h |
1,6 |
|
S. amsterdam |
3,10 |
g,m,s |
- |
|
S. zanzibar |
3,10 |
k |
1,5 |
К факторам вирулентности S. typhi относится Viантиген, представляющий собой капсульный полисахарид, защищающий микроб от фагоцитоза и комплемента. У подавляющего большинства других
208
сальмонелл Vi-антиген отсутствует.
Определение сероварианта сальмонелл (серологическая идентификация) по схеме Кауфмана-Уайта Выделенную культуру исследуют в ориентировочной реакции агглютинации на стекле с сальмонеллезной поливалентной сывороткой ABCDE. При положительном результате переходят к расшифровке сероварианта. Определение антигенной структуры начинают с выявления О-антигена. На крышку от чашки Петри наносят пастеровскими пипетками капли сывороток, содержащих антитела против основных соматических антигенов 2, 4, 6, 9 групп А, В, С, D, соответственно. Если с одной из сывороток наступит агглютинация (например, 0-4), дальнейшее определение вида осуществляют сыворотками против жгутиковых антигенов (Н) в специфической фазе в пределах установленной группы (0-4 группы В). Для агглютинации О-сы-вороткой следует брать верхнюю часть выросшей культуры на скошенном агаре, а для агглютинации Н-сыворотками – из конденсата или из самой нижней части роста. После установления принадлежности культуры к тому или иному виду определяют полную структуру О-антигенов и Н-антигена и таким образом устанавливают антигенную формулу (серовар) выделенной культуры. При отсутствии реакции агглютинации с поливалентной адсорбированной О-сывороткой к сальмонеллам групп ABCDE культуру испытывают с поливалентной сывороткой, включающей антитела к антигенам сальмонелл редких групп.
Лабораторная диагностика. Основу лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых сальмонеллами, выявления носительства, изучения обсемененности объектов окружающей среды, инфицированности пищевых продуктов составляет бактериологическое ис-
209
следование материала по стандартной схеме.
При проведении лабораторной диагностики тифопаратифозных заболеваний учитывают патогенетические особенности этих инфекций, связанные с локализацией возбудителя в лимфоидной ткани внутренних органов, крови, желчи и выделением его с испражнениями и мочой. В первые дни заболевания выделяют гемокультуру путем посева крови в соотношении 1:10 в жидкие питательные среды, например, желчную среду Рапопорт. Накопительные среды с желчью являются элективными для возбудителей тифо-паратифозных заболеваний. Другие бактерии на них не растут или рост их замедлен. Желчь препятствует свертыванию крови, нейтрализует нормальные антитела сыворотки, разрушает комплемент и тем самым снижает бактерицидные свойства крови при сохранении ее питательных свойств, а также препятствует действию бактериофага. Результаты посевов крови на среде Рапопорт учитывают через 18-24 ч, изучают характер роста. При брюшном тифе среда Рапопорт окрашивается в красныйцветвследствиеферментацииглюкозы,при паратифах А и В дополнительно выявляют газообразование. При отсутствии роста на среде Рапопорт посевы продолжают инкубировать и просматривают через 48, 72 ч, на 5-е и 10-е сутки. При наличии роста, после проверки на однородность выросшей культуры микроскопией окрашенного по Граму мазка, делают высев на дифференциально-диагностиче- ские среды. На 2-ой неделе заболевания выделяют копроили уринокультуру после посева фекалий и мочи на обогатительные и дифференциально-диа- гностические среды. Выделенную культуру идентифицируют по биохимическим и антигенным свой-
210
ствам. Из крови часто высевается брюшнотифозная культура, содержащая Vi-антиген, которая не агглютинируется О-сывороткой, т.к. Vi-антиген препятствует такой агглютинации. Если выделенный штамм не агглютинируется или агглютинируется не до диагностического (менее ½) титра, ставят реакцию агглютинации на стекле с Vi-сы-вороткой. Все культуры S. typhi фаготипируют с помощью набора Vi-фагов. Определяют чувствительность патогена к антибактериальным препаратам.
Для диагностики гастроэнтероколитов, возникающих в результате пищевых токсикоинфекций, для анализа отбирают испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, кровь, мочу, дуоденальное содержимое, секционный материал. Дополнительными объектами исследования являются остатки пищи, употреблявшейся заболевшими, исходные продукты и полуфабрикаты, корма животного и растительного происхождения, смывы с различного оборудования и предметов, предполагаемых в качестве фактора передачи возбудителя.
Окончательный диагноз пищевой токсикоинфекции устанавливают только после выделения возбудителя из организма больных людей и пищевых продуктов, его идентификации с установлением вида и серовара или биовара. Определение серовара проводят с помощью монорецепторных сывороток. Наиболее часто при токсикоинфекциях выявляют серовары S. typhimurium, S. enteritidis, S. anatum.
Возбудителем внутрибольничного сальмонеллеза чаще всего является S. typhimurium, которая может встречаться в виде трех биоваров, одинаковых по антигенной структуре, но различающихся по патогенности для белых мышей при энтеральном заражении и
211
по чувствительности к антибиотикам. Однако нередки заболевания, вызываемые S. derby, S. heidelberg, S. wien, S. haifa и др., которые относятся к группе В. Эти сальмонеллы по своим морфологическим, физиологическим и антигенным признакам не отличаются от возбудителей пищевых токсикоинфекций.
Как правило, сальмонеллы, выделяемые при внутрибольничной инфекции, резистентны к 15-20 антибиотикам. Это связано с наличием у них конъюгативных R-плазмид, несущих множественную устойчивость к антибиотикам. Лабораторная диагностика внутрибольничных сальмонеллезов осуществляется по общепринятой схеме.
Серологические исследования. Серологическую диагностику брюшного тифа и паратифов, выявление и дифференциацию различных форм носительства проводят постановкой реакции агглютинации Видаля с О- и Н-диагностикумами. Основное диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. Н-антитела появляются позже О-антител и сохраняются после болезни или прививки более длительное время. Положительная реакция Видаля только с Н-диагностикумом указывает либо на ранее перенесенное заболевание (анамнестическая реакция) либо появляется в результате вакцинации (прививочная реакция). Диагностический титр с О-антигеном - 1:200. Большое значение для диагностики имеет нарастание титров в течение болезни.
Постановка реакции Видаля Реакцию ставят с О-монодиагностикумом и Н-тифоз-
ными, Н-паратифа А и Н-паратифа В. На каждый диагностикум готовят ряд разведений испытуемой сыворотки. Контроль сыворотки – один для всех диагностикумов (таб.12).
212
Таблица 12
Постановка реакции Видаля
Ингредиенты |
|
|
П р о б и р к и |
|
|
||
(мл) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 (КС) |
6 (КА) |
|
Физиологический раствор |
- |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
- |
1,0 |
|
Сыворотка больного |
1,0 |
Титровать по 1,0 |
1,0 |
- |
|||
(1:100) |
|||||||
|
|
|
|
|
|
||
Диагностикум х (капли) |
1-2 |
1-2 |
1-2 |
1-2 |
- |
1-2 |
|
Конечное разведение |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
- |
- |
|
сыворотки |
|||||||
|
|
|
|
|
|
РНГА чувствительна и специфична с эритроцитарными О- и Vi-диагностикумами. Диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. антитела к Vi-антигену невысоки. Vi-антитела после полного выздоровления быстро исчезают, но при наличии брюшнотифозного носительства они присутствуют постоянно. В связи с этим РНГА с эритроцитарным Vi- диагно-стикумом применяется для выявления бактерионосительства.
Эффективным способом экспресс-диагностики сальмонеллезных и некоторых других болезней являются экспресс-тесты. Определение патогенных микроорганизмов с помощью Singlepath-тестов производства фирмы Merck (Германия) основано на методе визуальной иммунохроматографии (разновидность иммуноферментного анализа).
Singlepath-тест Salmonella представляет собой диагностическую панель с лункой для добавления обогащенного образца, тестовой (Т) и контрольной (С) зонами. Антигены определяемых в образце бактерий взаимодействуют с меченными золотом антителами, включенными в состав теста, с образованием окрашенного комплекса антиген-антитело. Окрашенный комплекссвязываетсясиммобилизованнымиантителамис образованием линий в тестовом и контрольном окнах.
213
Схема выявления сальмонелл из образцов продуктов:
1.Неселективное обогащение на забуференной пептонной во-де (25 г образца + 225мл BPW) при 37°С в течение 18-24 ч.
2.Селективное обогащение на среде RVS - RappaportVassiliadis (магниевая среда). 0,1 мл культуральной жидкости добавляют к 9,9 мл RVS среды. Инкубируют при 41°С 18-24 ч.
3.Инактивация. 2 мл культуральной жидкости прогревают на водяной бане при 100°С в течение 15 мин.
4.Singlepath-тест. В лунку диагностической панели вносят 160 мкл инактивированной культуральной жидкости. Результаты учитывают визуально в тестовой и контрольной зонах через 20 мин.
5.Подтверждение. Высев положительных результатов
на дифференциально-диагностические среды РАМ- БАХ-агар, XLD-агар или висмут-сульфитный агар. Преимущества метода:
•Экспрессность. Результат через 20 мин.
•Надежность. Высокая чувствительность и специфичность метода (99%). Ясный и четкий положительный или отрицательный результат. Встроенный положительный контроль.
•Легко использовать. Нет необходимости в ходе исследов ания добавлять какие-либо реагенты. Все компоненты включены в одну тест-пластинку. Отсутствуют сложные этапы в исследовании. Одноэтапный формат теста исключает возможные ошибки.
•Удобный. Необходимо добавить образец и учесть результат.
•Экономичный. Сокращает время исследования, снижает трудозатраты, уменьшает количество пересевов.
•Нет необходимости приобретать и обслуживать до-
214
рогостоящее оборудование.
Singlepath-тест одобрен Федеральным Центром Госсанэпиднадзора РФ (МР №24ФЦ/976) и разрешен к применению в лабораториях санитарно-эпидемиологиче- ской службы, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в производственных лабораториях.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Занятие 1.
Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia,
Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morga-nella, Proteus, Yersinia,
Edwardsiella)
•Изучение морфологии роста на скошенном агаре.
•Изучение морфологии микробов в мазках, окрашенных по Граму.
•Постановка пробы Gregersen с 3% КОН.
•Посев полученной культуры на среду Клиглера, в среды минимального дифференцирующего ряда, на ско-
шенный МПА, среды Эндо, Плоскирева, ЭМС, ВСА.
Примечания:
-при посеве на пластинчатые среды получить рост изолированных колоний;
-здесьивдальнейшемпосевыинкубировать18-24чпри37°С;
-посевы в среду Кларка и полужидкий агар дублировать и инкубировать при 37 и 22°С.
Занятие 2.
Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Entero- bacter,Hafnia,Serratia,Morga-nella,Proteus,Yersinia,
215
Edwardsiella)
•Изучение морфологии колоний на дифференциаль- но-диагностических средах.
•Изучение морфологии роста культуры в бульоне.
•Подготовка мазков из бульонной и агаровой культур, окрашивание их по Граму.
•Учет результатов роста культуры на среде Клиглера и в средах минимального дифференцирующего ряда.
•При необходимости проведение предварительной серологической диагностики испытуемой культуры.
•Предварительное заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.
Примечание: при отрицательном результате реакции Фогеса-Проскауэра посевы на среде Кларка инкубировать еще 18-24 ч.
Занятие 3.
Биологические свойства представителей родовых групп семейства энтеробактерий (Escherichia,
Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Morga-nella, Proteus, Yersinia,
Edwardsiella).
•Изучение морфологии 2-суточного роста культур на висмут-сульфитном агаре.
•Учет результатов роста в средах минимального дифференцирующего ряда через 48 ч.
•Постановка реакции с метиловым красным и Фоге- са-Проскауэра.
•Заключение о родовой принадлежности изучаемой культуры.
Занятие 4. Бактериологический диагноз эшерихиозов
216