2 курс / Гистология / КОЛИЧЕСТВЕННАЯ_ОЦЕНКА_ИЗМЕНЕНИЙ_В_МИКРОСТРУКТУРЕ_ПЕРИНЕЙРОНАЛЬНЫХ

целые органы лягушек, мышей, крыс [135]. Органы в плоской кювете с физиологическим раствором наблюдали снизу через покровное стекло с помощью иммерсионного объектива. Предметный столик передвигали штативом.

3.Первый конфокальный микроскоп, использующий лазер (США,

Йельский университет) [136, 137]. Лазер не только даёт излучение с высокой яркостью, но и может считаться источником параллельных лучей, то есть можно не использовать конфокальную диафрагму на источнике света.

Однако это появилась новая проблема – интерференция света может создавать пятнистость изображения в плоскости конфокальной диафрагмы детектора. Решением стало подавление света, рассеянного внутри микроскопа поляризационным и модуляционным способами: синхронный усилитель усиливал только ту часть сигнала, поступающего c

фотоумножителя, которая модулировалась прерывателем между объективом и объектом.

4. Первый конфокальный флуоресцентный микроскоп [138], который был сканирующим вариантом микрофлуориметра [139]. Предметный столик приводился в движение в горизонтальной плоскости синхронно со строчно-

кадровой разверткой луча на экране осциллографа, а сигнал c

фотоумножителя модулировал яркость этого луча.

Этот микроскоп детектировал достаточно большой флуоресцентный сигнал.

Для исследования объекта использовалось сразу несколько методов:

сканирующая неконфокальная флуоресцентная микроскопия (как с применением компьютерного усиления контраста, так и без него) и

конфокальная сканирующая микроскопия (как в рассеянном свете, так и в свете флуоресценции). По результатам исследования был сделан вывод о преимуществе конфокальной флуоресцентной микроскопии, что стало толчком к ее дальнейшему развитию.

Во флуоресцентной конфокальной микроскопии распространённой является фотоэлектрическая регистрация сигнала. Однако она приводит к

41

https://t.me/medicina_free

тому, что теряется цветовой контраст, который обеспечивает обычная флуоресцентная микроскопия. Это особенно заметно при использовании нескольких флуорофоров. Для устранения этого недостатка идущую от объекта флуоресценцию, уже прошедшую конфокальную диафрагму детектора, с помощью дихроичных зеркал и блокирующих светофильтров можно разделить на несколько спектральных каналов с отдельными детекторами. Каждый канал впоследствии можно закодировать определённым цветом и наложить друг на друга. Возбуждение флуорофоров лазером позволяет получать достаточно мощный поток флуоресценции,

чтобы иметь возможность разлагать его в спектр с разрешением до 1 нм.

Еще одна проблема конфокальной флуоресцентной микроскопии – появление расплывчатых пятен в окуляре из-за частиц, которые находятся выше или ниже плоскости фокусировки микроскопа. Эти пятна сливаются друг с другом и возникает фон вокруг изображения. Если уменьшить отверстие полевой диафрагмы осветителя, то изображение становится более контрастным. Происходит это за счет того, что уменьшается только площадь резкого изображения при неизменной его освещенности, а освещенность фона снижается пропорционально площади резкого изображения при неизменной функции распределения этого фона в поле зрения окуляра. В

результате отношение сигнала к фону увеличивается и растет контраст изображения. Решить проблему за счет сканирования объекта не получается,

поскольку средняя по времени освещенность сфокусированной части изображения становится меньше во столько же раз, во сколько раз сканируемая площадь превышает площадь зондирующего пятна. В то же время освещенность фона почти не уменьшается, так как фон, создающийся при разных положениях светового зонда, суммируется. Контраст изображения остается на том же уровне, что и при большом отверстии в полевой диафрагме.

Для решения проблемы фона можно также сканировать объект одновременно полевыми диафрагмами осветителя (опак-иллюминатора) и

42

https://t.me/medicina_free

микроскопа. При этом среднее по времени изображение получается таким же контрастным, как и при неподвижном узком световом зонде за счет отсечения фона диафрагмой с отверстием, пропускающим только контрастное изображение освещенного узкого участка. Но эта диафрагма должна перемещаться в плоскости изображения. Высокое отношение сигнала к фону в изображениях микроскопа зависит от размера отверстий в полевых диафрагмах. Таким образом появились конфокальные (софокусные)

микроскопы, где полевые диафрагмы осветителя и микроскопа фокусируются на один небольшой участок исследуемого объекта. Сам термин «конфокальный микроскоп» стал применяться позже, с 1977 г. [140].

Контраст получаемого изображения в таких микроскопах зависит от размера отверстий в полевых диафрагмах микроскопа. Они должны иметь диаметр, равный интервалу, который разрешен оптикой этого микроскопа.

Если их уменьшать, то будет снижаться освещенность области наблюдения.

Отношение сигнала к фону определяет контраст получаемого изображения

(сохраняется и при включении сканирования). При этом сигнал – это часть светового потока, которая относится к выделенному конфокальными диафрагмами исследуемому объекту, а фон – та часть светового потока,

которая относится к другим частям объекта.

Ещё одной важной характеристикой конфокального микроскопа является его разрешающая способность, то есть возможность различения двух близких по интенсивности точечных объектов. При рассмотрении изображения бесконечно малого источника света будут наблюдаться кольца Эйри, которые являются результатом дифракции света на границах линз.

Если размер светящегося объекта меньше диска Эйри, возможна лишь констатация факта его существования. Размер, форма, структура такого объекта не могут быть определены. Величина, обратная разрешающей способности, называется пределом разрешения оптической системы. Она представляет из себя наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором они еще различимы. Предел разрешения,

43

https://t.me/medicina_free

обусловленный дифракцией, ограничивает возможность видеть две близкие точки препарата раздельно: если расстояние между дисками Эйри от двух точечных источников света мало, по сравнению с их величиной, то распределение интенсивности света в изображении будет такое же, как от одного источника света. Согласно критерию Рэлея, две светящиеся точки можно различить как отдельные, если центр диска Эйри от одной точки приходится на первое темное кольцо (первый дифракционный минимум)

вокруг диска Эйри от второй точки.

Рисунок 9. Схематическое устройство конфокального микроскопа. Заимствовано из

Мухитов А., Архипова С., «Методы световой микроскопии для биологических и

медицинских исследований» [126]

44

https://t.me/medicina_free

В световой микроскопии различают несколько видов разрешения:

латеральное (xy), аксиальное (z), временное (t) и спектральное (λ). Согласно критерию Рэлея предел для латерального разрешения D( ) = (0.61 λ)/ , а

для аксиального разрешения – ( ) = (2 λ)/( )2, где λ – длина волны света,

NA – числовая апертура линзы ( = sinα, где α – апертурный угол

(наибольший угол между оптической осью объектива и лучами,

попадающими в объектив), n – показатель преломления среды). Латеральное разрешение при прочих равных условиях в 2÷4 раза выше, чем аксиальное.

Из этих формул следует два основных вывода:

1.Повысить разрешающую способность микроскопа можно за счет увеличения числовой апертуры объектива (NA) и уменьшения длины волны света (λ). Числовую апертуру объектива (NA) часто увеличивают, применяя иммерсионные среды с высоким показателем преломления (n).

2.С учетом свойств современных высокоапертурных объективов и иммерсионных жидкостей и самой короткой длины волны видимого света латерального разрешения является 200 нм. Эту величину называют дифракционным пределом.

При размере конфокальной диафрагмы, равной размеру диска Эйри,

ЛСКМ работает наиболее эффективно. Если флуоресцентный сигнал от препарата слабый, можно увеличить размер пинхола, но при этом снижается качество изображения, в том числе контраст и аксиальное разрешение. Если размер пинхола меньше, чем диск Эйри, это обычно не ведет к улучшению аксиального разрешения, поскольку значительно снижает количество света,

попадающего на детектор, и этим ухудшается соотношение сигнал/шум.

Скорость сканирования задается качеством изображения и определяет временное разрешение ЛСКМ.

Ещё одной формой разрешения ЛСКМ является разрешение цифрового изображения. Для него разрешение определяется количеством и размером пикселей (picture elements). Разрешение (и качество изображения) обратно пропорциональны размеру пикселя, который содержит информацию о

45

https://t.me/medicina_free

некотором участке объекта. Критерий Найквиста связывает оптическое разрешение и разрешение изображения, согласно которому для достижения максимального разрешения размер пикселя изображения должен быть в 2-3

раза меньше предела разрешающей способности микроскопа. Если он больше – происходит потеря качества изображения, если меньше, то на изображении могут появляться структуры, которых на самом деле нет.

Различные виды разрешения конкурируют друг с другом, например,

пространственное и временное. Улучшить пространственное разрешение можно за счет более длительного сканирования. Свойства света налагают ограничения на увеличение, которое дает микроскоп, что отражено в существовании дифракционного предела разрешающей способности. После достижения предела разрешающей способности любое увеличение будет

«пустым»: будет увеличиваться размер изображения, но не его детализация.

Максимальное полезное увеличение оптической системы (M)

определяется по формуле: = / 1 , где D – предел разрешения человеческого глаза, D1 – предел разрешения оптической системы. Так как предел разрешения человеческого глаза составляет 1-2 угловые минуты, что для здорового глаза с расстояния наилучшего видения составляет порядка 0.3

мм, а предел латерального разрешения светового микроскопа – около 200 нм,

то максимальное полезное увеличение обычного светового микроскопа около

1500 раз. Из этой формулы также следует (если подставить в нее вместо D1

формулу предела латерального разрешения и принять, что λ видимого света в среднем равна 500 нм), что максимальное полезное увеличение обычного микроскопа составляет около 1000 числовых апертур объектива.

2.4. Использования конфокальной микроскопии

Для исследовательских целей и решения практических задач можно создавать трехмерные модели объектов, используя двухмерные массивы данных, полученные с помощью конфокального микроскопа. Для толстого объекта могут быть получены контрастные изображения отдельных

46

https://t.me/medicina_free

оптических сечений. Здесь важно не превышать аксиальное разрешение микроскопа и соблюдать равное расстояние между сечениями.

В настоящее время конфокальные активно используют микроскопы в фундаментальных исследованиях в биологии и медицине. В практической медицине их применяют в офтальмологии, например, в конфокальной микроскопии роговицы (более 50 работ в обзоре с 1994 по 2005 гг.) [141]. Из них более 60% было выполнено c применением щелевых конфокальных микроскопов, в остальных использовались микроскопы со сканирующим диском.

Конфокальный офтальмоскоп вместо объектива использует оптический аппарат глаза. Несмотря на небольшое разрешение офтальмоскопа удается получать послойное изображение сетчатки глаза за счет отсечения фона и высокого контраста изображения. Это дает возможность диагностики патологии сетчатки.

Современные конфокальные микроскопы обычно могут работать в мультиспектральном режиме, получая данные от объекта, окрашенного сразу несколькими красителями. Этот режим позволяет исследовать колокализации в клетке нескольких веществ (например, белков) для понимания причинно-

следственных связей между ними. Для этого их метят антителами с разными флуоресцентными метками.

К мультиспектральным исследованиям можно отнести исследования спектров испускания клеток и их компартментов, живых и фиксированных

(обработанных формалинами). Пример такого исследования -

цитогенетический метод FISH (Fluorescence in-situ hubridisation), при котором происходит выявление специфических последовательностей ДНК или хромосом при помощи флуоресцентных зондов.

47

https://t.me/medicina_free

Глава 3. Экспериментальная часть. Параметры экспериментов и анализ изображений

3.1. Изменения микроструктуры PNN в постнатальном развитии головного мозга и при травме спинного мозга. Эпифлуоресцентная микроскопия низкого разрешения

Пробоподготовка.

Подготовка тканей спинного мозга проводилась на базе Центра Нейронаук Университет Хельсинки. Подготовка тканей головного мозга проводилась на базе Института Фундаментальной Медицины и Биологии Казанского Федерального Университета.

Подготовка ткани мозга.

Образцы мозга мышей 14, 21 и 28 дней после рождения были собраны в соответствии с положениями комитета по этике Казанского Федерального Университета. Все применимые институциональные рекомендации по уходу и использованию животных были соблюдены. Все процедуры, проводимые в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим нормам учреждения, в котором проводились исследования. Для исследований животных терминально анестезировали внутрибрюшинной передозировкой уретана (Sigma-Aldrich) и сразу же перфузировали через сердце 30–50 мл охлаждённого льдом фосфатно-солевого раствора (PBS, pH 7.4), а затем 30– 50 мл охлаждённого на льду 4% параформальдегида, введённого со скоростью 10 мл/мин.

Для извлечения образцов коры головного мозга мышей обезглавливали, череп разрезали от большого затылочного отверстия

(foramen magnum) до лямбды с помощью микрохирургических ножниц.

После этого межпариетальные, теменные и лобные костные пластинки осторожно удаляли микрохирургическим пинцетом, чтобы обнажить кору.

Диссекцию коры контролировали с помощью бинокулярного микроскопа. В

случае повреждения ткани образцы исключались из эксперимента.

48

https://t.me/medicina_free

Образцы ткани мозга были фиксированы в течение ночи в 4%

параформальдегида при 4°С. После этого ткани подвергали криопротекции с использованием 30% сахарозы в течение 48 часов, а затем замораживали в заливочной среде Tissue-Tek (Sakura). Для контроля точной ориентации образцов, помещенных в Tissue-Tek, использовались тонкие сетки на ванночках для заливки (Sakura), чтобы отметить границу расположения образца ткани. Затем несколько капель Tissue-Tek наносили на форму и охлаждали до тех пор, пока она не становилась высоковязкой. После этого образец головного или спинного мозга помещали внутрь. Высокая вязкость заливочной среды позволяла контролировать ориентацию ткани и предотвращать изгиб спинного мозга вдоль дорсовентральной оси. Наконец,

образец был полностью погружен в Tissue-Tek и инкубирован в коробке с сухим льдом до полного замораживания (около 30 минут). После этого формы с образцами охлаждали до -80°С и хранили в бумажной коробке в течение 1-2 дней перед криосекцией.

Срезы тканей головного мозга толщиной 20 мкм получали с помощью

Thermo Cryotome FE & FSE A78910100 при температуре от -12 до -15°C.

Соматосенсорные области коры определяли при помощи сравнительного цитоархитектонического атласа мозга мыши (Patrick R. Hof, Elsevier). Срезы помещали на предметные стекла Menzel-Gläser Supefrost Plus (Thermo Scientific) и сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 10

минут до окрашивания WFA, как подробно описано ниже.

Покраска ткани мозга.

Для окрашивания PNN использовали биотинилированный агглютинин

Wisteria Floribunda (Vector-Lab, США). После нарезки образцы трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4) для удаления заливочной среды. Затем срезы обрабатывали в течение 1 часа блокирующим раствором: 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma) в 0,1 М PBS.

Для блокирования эндогенного биотина использовали набор для блокирования стрептавидина/биотина (Vector Lab, США) в соответствии с

49

https://t.me/medicina_free

протоколом производителя. После этого срезы быстро промывали в PBS и

инкубировали в течение ночи при +4°C с биотинилированным WFA в

конечной концентрации 2 мкг / мл (разведение 1:1000) в PBS с 10 мМ

HEPES, pH 7.4. Срезы промывали 4-5 раз в течение 5 минут в PBS и

инкубировали в течение 30 минут со стрептавидином, коньюгированным с

AlexaFluor 633 (Invitrogen) (разведение 1:100) в PBS (pH 7.4). Наконец, срезы промывали 4–5 раз в течение 5 минут в PBS, сушили на воздухе и помещали на стекла при помощи ImmunoMount (Thermo Scientific). Для контроля специфичности окрашивания срезы головного мозга обрабатывали стрептавидином, коньюгированным с AlexaFluor 633 в отсутствии WFA.

Травма спинного мозга

Все протоколы для экспериментов по травме спинного мозга были одобрены ELLA (Экспериментальным советом по животным в Финляндии),

номера разрешений: ESLH-2008-09065 / YM-23 и ESAVI / 11326 / 04.10.07 /

2014. Самок мышей C57bl/6 в возрасте 1 месяц анестезировали внутрибрюшинной инъекцией смеси кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10

мг/кг). После ламинэктомии на уровне позвонка С5 была тщательно удалена твердая мозговая оболочка. Шейный отдел позвоночника был перерезан справа шприцевой иглой 25G от срединного спинного сосуда в латеральном направлении. Контрольным животным делали ложную операцию,

включающую ламинэктомию, в то время как спинной мозг и твердая оболочка спинного мозга оставались нетронутыми. После наложения швов на кожу и мышцы мышей держали в теплой восстановительной клетке в течение 2–4 ч, пока животные не обрели способность двигаться. Животным давали Римадил (5 мг/кг, Pfizer) и Рапидексон (0.2 мг / кг, Evrovet) для уменьшения боли и воспалительного отека в течение следующих 3-4 дней после операции, пока животные не перестали терять вес тела. В результате операции несколько животных были в тяжелом состоянии - они не могли двигаться в течение 3 дней после повреждения спинного мозга и теряли

50

https://t.me/medicina_free