2 курс / Гистология / Введение_в_иммуноцитохимию_Полак_Дж_,_Ван_Норден_С_
.pdf3. Условия для проведения иммуноцитохимии |
21 |
реакцию по желанию можно остановить. Необходимо конт ролировать соотношение количества флуоресцентной или ферментной метки с количеством антител при конъюгации. Избыток метки может повлиять на активность антител; несвязавш ую ся метку необходимо удалить до использования антител путем диализа или колоночной хроматографии. Все молекулы антител должны нести метку, так как немеченые
лнтитела будут конкурировать с мечеными за |
антиген и, |
та |
ким образом, снижать количество видимого |
продукта |
ре |
акции. |
|
|
Помимо ферментных методов с использованием немеченых антител было предложено еще несколько способов усиления интенсивности окраски при пероксидазной реакции. Эти ме тоды основаны либо на повышении чувствительности реакции, что позволяет выявлять меньшее количество антигена при той же концентрации антител, либо на повышении специфичности реакции. В этом случае то ж е самое количество антигена уда ется выявить при меньшей концентрации антител, что дает
возможность |
вывести |
из реакции загрязняю щ ие |
антитела за |
|||
счет разведения. Д ля |
докраш ивания ядер |
или |
компонентов |
|||
ткани нужно |
выбирать |
такие |
реагенты, которые обеспечат |
|||
контрастный |
фон и не |
снизят |
интенсивности |
основного окра |
шивания.
Дл я световой микроскопии окраску золотом (см. разд. 6.4) можно усилить при помощи эпиполяризационной оптики (см.
разд. |
1 0 ) или |
нового |
метода, основанного на осаждении се |
ребра |
(H olgate |
et al., |
1938, а, b). Что ж е касается электронной |
микроскопии, то преимущество коллоидного золота как метки состоит в том, что его частицы лучше видны на фоне докра шенного обычными способами препарата, чем продукт перо
ксидазной |
реакции |
после |
проявления |
диаминобензидином |
|
(ДА Б) |
и обработки |
осмием. |
|
||
М етод |
мечения |
антител флуоресцеинизотиоцианатом |
|||
(Ф ИТЦ ) |
прост и вкратце |
сводится к |
следующему (Stern- |
||
berger, |
1979): |
|
|
|
|
1 ) |
выделение IgG; |
|
|
2)реакция с Ф ИТЦ при щелочном pH и правильном соот ношении реагента и антител;
3)очистка антител от свободного Ф ИТЦ на колонке с сефадексом G25;
4)разделение меченых и немеченых IgG на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.
При мечении пероксидазой для |
присоединения |
фермента |
|
к антителам |
используют, например, |
глутаровый |
альдегид. |
Приготовить |
ПАП -комплекс сложнее; для этого требуется до |
полнительная очистка. При мечении золотом антитела присое
22 3. Условия для проведения иммуноцитохимии
диняют к частицам золота за счет нековалентной адсорбции. Эти реактивы можно купить. Они, конечно, дороги, однако* их стоимость частично компенсируется экономией времени и:
усилий, которые тратятся на приготовление собственных реа гентов.
Все антитела, собственного производства или приобретен ные, перед употреблением необходимо оттитровать на заве домо положительном материале, для того чтобы найти рабо чее разведение, которое зависит такж е и от времени окраш и вания. Короткая инкубация (10— 60 мин) требует более высо кой концентрации антител, чем длительная (12— 24 ч), и не редко приводит к повышению неспецифического связывания,,
так |
как в этом случае не происходит необходимого разведе |
ния |
загрязняю щ их антител. |
4. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ
4.1. Прямой метод
Исходная методика |
окраш ивания, разработанная |
Кунсом |
|
(Coons, K aplan, 1950), |
была одностадийной |
(прямой); |
в этом |
случае Ф И ТЦ присоединяли прямо к специфическим |
антите |
||
лам . Меченую антисыворотку разводили |
физиологическим |
раствором, забуференным с помощью фосфата (ЗФ Ф Р ), а за тем наносили на срез ткани и после инкубации несвязавшие-
ся антитела удаляли, промывая |
срез ЗФ Ф Р. |
Окрашенный |
|
срез |
просматривали в микроскоп |
с ультрафиолетовой опти |
|
кой; |
при этом в точках связывания антител |
наблю дали яб |
лочно-зеленую флуоресценцию (рис. 3).
4.2. Непрямой метод
Оригинальная методика была модифицирована, -и сейчас широко используется непрямой метод (Coons et al., 1955; рис. 4 и 5, а такж е фото 1). В этом случае за первыми спе цифическими немечеными антителами следует второй слой, содержащ ий антитела к у-глобулинам животного, донора пер вых антител, например козьи антитела к у-глобулинам кро лика, меченные ФИТЦ . Первые антитела (кроличьи), связав шиеся с участками среза ткани, содержащ ими нужный анти ген, в свою очередь служ ат антигеном для вторых флуорес центных антител (рис. 6 ).
Достоинства метода
1. Антисыворотки к IgG обычно имеют высокий титр и авидность.
2.С каждой молекулой первого (специфического) анти тела могут связаться две меченые молекулы антииммуногло булинов, что увеличивает чувствительность метода.
3.Экономичность. Один препарат флуоресцентных антител второго слоя может быть использован для окраш ивания мно жеством первых антител, взаимодействующих с разнообраз ными антигенами; необходимо только, чтобы все они были по лучены при использовании животных одного вида, а именно
того, к IgG |
которого специфичны антитела |
второго |
слоя. |
В настоящее |
время налаж ен выпуск меченых |
антител |
для |
24 4. Иммунофлуоресцентные методы
Специфическая реакция антиген—антитело с мечеными
первыми антителами
Связывание с Fc-Образование гидрофобных и |
Загрязняющие антитела |
|
рецепторами (только на |
электростатических связей (специфические, но ненужные^ |
|
нефиксированной ткани) |
между мечеными Ig и |
|
|
компонентами ткани |
|
ч*
" < 3vV
|АГ
!А[
Блокирование |
Блокирование гидрофобных |
Осуществление специфичес- |
Fc-рецепторов |
и электростатических |
ких реакций с участием |
|
взаимодействий |
основных и загрязняющих |
|
|
антител |
Рис. 3. Прямой метод. А. Первые антитела конъюгированы с флуоресцеиноь® (или с пероксидазой). Неспецифические антитела также оказываются ме чеными. Б. Показаны некоторые неспецифические реакции, связанные с возникновением гидрофобных и электростатических взаимодействий между иммуноглобулинами и компонентами ткани, а также реакции загрязняющих антител с антигенами ткани. Путем обработки срезов неконъюгированной неиммунной сывороткой животного, донора антител, или инертным белком, таким, как альбумин, до инкубации с первыми антителами эти реакции можно частично блокировать. В. Метод удобен для окрашивания по двум? антигенам одновременно; в этом случае два препарата первых антител ме тят разными метками, например родаминизотиоцианатом и флуоресцеини-
зотиоцианатом (Valnes, B randtzaeg, 1982).
4. Иммунофлуоресцентные методы |
25 |
Рис. 4. Срез толстого кишечника человека. Окрашивание проводили с по мощью непрямого иммунофлуоресцентного метода с использованием кро личьих антител к глюкагону и конъюгированных с флуоресцеином козьих
антител к IgG кролика. Видны энтероглюкагоновые клетки; |
|
основание |
|||
флуоресцирующих клеток покоится на базальной мембране |
(стрелка), апи |
||||
кальная поверхность обращена |
к просвету. Подготовка |
ткани: |
ткань |
||
фиксировали раствором я-бензохинона; толщина криостатных |
|
срезов — |
|||
6 мкм. |
|
|
|
|
|
второго слоя. Помимо флуоресцеина используют |
и |
другие |
|||
метки, например родамин, |
флуоресцирующий |
в |
оранж ево |
||
красной области, однако интенсивность свечения у |
|
него |
ни |
||
же, чем у ФИТЦ . Родамин обычно используют при |
окраш и |
||||
вании по двум антигенам |
одновременно. |
|
|
|
|
3— 1203
26 Иммунофлуоресцентные методы
1 0 * К-Г4
Рис. 5. Срез желудка крысы. Окрашивание проводили при помощи непря
мого иммунофлуоресдентного метода с использованием |
кроличьих |
антител |
к вазоактивному интестинальному полипептиду (ВИП) |
и козьих |
антител |
к IgG кролика, конъюгированных с флуоресцеином; в мышечной ткани стенки желудка видны нервные волокна, содержащие ВИП. Обратите вни мание на типичные расширения. ВИП — пептидный нейропереносчик, сти мулирующий секрецию, расширение сосудов и расслабление мышц. Под готовка ткани: ткань фиксировали я-бензохиноном; толщина криостатного ср еза — 10 мкм.
Иммунофлуоресцентные методы |
27 |
Меченые вторые антитела (козьи антитела к JgG кролика)
Немеченые первые антитела (кролика)
первого слоя с |
связывание Ig . |
загрязняющих |
рс-рецепторами |
первого слоя с тканью |
антител с тканью |
В
Блокирование |
Блокирование гидрофобных |
Специфические Специфические |
|
Fc-рецепторов |
и электростатических |
реакции |
реакции с участием |
|
взаимодействий |
|
загрязняющих |
|
|
|
антител |
Рис. 6. Непрямой метод. Некоторые неспецифические реакции (Б) могут быть подавлены (В) путем обработки инертным белком или неконъюгированной неиммунной сывороткой донора вторых антител до инкубации с первыми антителами.
3*
5.ИММУНОФЕРМЕНТНЫЕ МЕТОДЫ
5.1.Антитела, конъюгированные с ферментом,— непрямой метода
П ероксидаза впервые была использована для мечения ан тител в 1966 году (N akane, Pierce, 1966) и теперь во многих случаях применяется вместо флуоресцеина. Принцип метода непрямого окраш ивания тот же, но антитела визуализируют при помощи гистохимической реакции на пероксидазу; в ка честве субстрата обычно используют диаминобензидин (G ra ham, Karnovsky, 1966).
Достоинства метода
Метод дает возможность иметь постоянные препараты, по
скольку интенсивность окраски |
со временем не падает, как |
при флуоресцентном мечении. |
П репараты можно просматри |
вать в обычный микроскоп и гораздо проще фотографировать. |
Окрашенные тонкие нервные волокна особенно удобно анали зировать при помощи оптической системы Номарского. Пероксидазный метод можно использовать и на ультраструктурном уровне; для этого продукт реакции обрабатываю т тетра окисью осмия, что делает осадок электроноплотным.
Недостатки метода
Метод включает две дополнительные стадии и соответст венно две промывки, во время которых срез может оторвать
ся от предметного стекла; кроме того, |
процедура окраш ивания |
|||||||
удлиняется. П ервая |
дополнительная |
стадия — погружение |
||||||
среза в раствор перекиси водорода в |
метаноле или в бу |
|||||||
фере |
для |
истощения |
эндогенной |
пероксидазы, которая |
||||
может |
спутать |
всю |
картину |
окраш ивания. |
Другой |
спо |
||
соб ингибирования — блокирование |
реакции перйодатом и |
|||||||
борогидридом |
(H eyderm an, |
1979), |
нитроферрицианидом |
|||||
натрия |
или |
фенилгидразином |
(S traus, 1971, |
1972). |
Вто |
|||
рая дополнительная стадия — гистохимическое |
проявление |
пероксидазы. Кроме того, известно, что бензидин, производ ным которого является диаминобензидин (Д А Б ),— потенци альный канцероген (Труды М еждународного общества по изу* чению рака, 1972). Однако следует отметить, что вывод о кан церогенное™ бензидина был сделан на основании результа
|
|
5. Иммуноферментные методы 29 |
|
тов обследования |
людей, |
действительно |
длительное время |
контактировавш их |
с этим |
веществом на |
промышленном про |
изводстве; при этом концентрация его была значительно вы ше той, с которой сталкивается человек, ведущий гистохими
ческие |
исследования (25— 50 |
мг |
на 100 |
м л). Наконец, Вайс- |
бергер |
с сотр. (W eisburger et |
al., |
1978) |
получили результаты , |
свидетельствующие о том, что диаминобензидин, образующ ий ся при добавлении к бензидину двух аминогрупп, почти не обладает канцерогенными свойствами. Однако все ж е лучше соблюдать осторожность и избегать контакта с диаминобензидином и загрязнения этим веществом лаборатории. П ро явление Д А Б лучше проводить всегда в одном и том ж е мес те, предпочтительно под тягой; с раствором этого соединения следует работать в перчатках; после окончания работы стек
лянную посуду, инструменты и пробки |
обрабатываю т |
гипо |
|||||
хлоритом |
натрия |
(обычный |
домашний |
отбеливатель). |
Д ля |
||
хранения |
раствор |
Д А Б |
лучше всего разделить на |
небольшие |
|||
порции и заморозить ( |
разд. |
П .8 ). Есть |
и другие |
реагенты, |
|||
которые, |
как считается, |
не |
обладаю т канцерогенными |
свой |
ствами, например реагент Хэнкера — Йейтса, я-фенилендиа-
мин с пирокатехолом |
(H anker et |
al., 1977) или З-амино-9-этил- |
|||
карбазол |
(G raham |
et |
al., 1965). |
Однако |
недавно появились |
сообщения |
о том, |
что |
последнее |
вещество |
— такж е потенци |
альный канцероген и, следовательно, работая с ним, следует
соблюдать осторожность |
(Tubbs, |
Sheibani, 1982). Н аиболее |
|||
широко используется |
в |
качестве |
реагента |
Д А Б, так |
как он |
обеспечивает высокую |
чувствительность, |
конечный |
продукт |
||
реакции нерастворим |
и |
хорошо |
виден; |
окрашенные срезы |
|
можно обезвоживать |
и заклю чать для длительного хранения. |
Кроме того, конечный продукт можно сделать электроноплот ным путем обработки тетраокисью осмия.
5.2. Метод пероксидазы — антипероксидазы
Д альнейш ее развитие непрямой |
техники окраш ивания |
привело к разработке метода двойных |
иммуноглобулиновых |
мостиков (M ason et al., 1969) и ферментного метода с ис пользованием немеченых антител или метода пероксидазы —
антипероксидазы |
(ПАП ) (Sternberger, 1979). |
В этом случае |
требуется третий слой — очень стабильный |
комплекс кроличьих антител к пероксидазе, связанных с пероксидазой. ПАП -комплекс, образующий третий слой и со стоящий из кроличьих 7 -глобулинов и пероксидазы, служит антигеном для немеченых козьих антител к 7 -глобулинам кролика, формирующих второй слой. Козьи антитела к 7 -гло булинам кролика должны быть в избытке по отношению к
30 5. Иммуноферментные методы
ПАП-комплекс (IgG кролика)
Кроличьи анти (в очень низн концентрат-
|
Ё |
Связавшиеся с тканью Ig из |
Загрязняющие антитела |
неиммунной сыворотки НЕ |
в первом слое выводятся |
являются антителами к IgG |
из реакции благодаря |
кролика и, следовательно, |
сильному разведению |
не будут реагировать с ПАП |
|
Рис. 7. Ферментный метод с использованием немеченых антител (метод пе роксидазы — антипероксидазы, ПАП-метод, метод Стернбергера). Перед добавлением первых антител проводят блокирование неиммунной сыворот кой животного, донора вторых антител.
первому слою. Это обеспечит конкуренцию антител за свя занные с антигеном специфические антитела первого слоя, в данном случае выступающие в качестве антигена, а второй антигенсвязывающий участок сможет взаимодействовать с ПАП -комплексом, вторым антигеном (рис 2, 7 и 8 ).
Достоинства метода
Чувствительность метода повышается в 1 0 0 — 1000 раз, так как молекулы пероксидазы связаны с антителами, не хими чески, а как антиген с антителом, что не сопровождается потерей ферментативной активности. Кроме того, в точке, где идет реакция, оказывается сосредоточенным гораздо большее
количество пероксидазы, чем в случае непрямого |
метода. |
||
Можно такж е |
использовать более высокие разведения пер |
||
вых антител и, |
таким образом, вывести из реакции многие з а |
||
грязняющ ие антитела, что |
понизит неспецифическое |
окраш и |
|
вание. М етод обеспечивает |
очень высокую специфичность ре |
акции, так как ПАП -комплекс представляет собой высокоочищенный препарат и будет взаимодействовать только с антите лами к кроличьим ^-глобулинам из второго слоя. ПАП -ком плекс не будет реагировать с неспецифически связавш имися