51
нитриф ициру ю щ их и аммониф ициру ю щ их б актерий, актиномицетов, гриб ов, целлю лозных и дру гих микроорганизмов.
За д а ния д л я вы по л нения л а бо р а т о р но йр а бо т ы
1.О п ределить микроб ноечислоп очвы, сделать заклю чение.
2.Провестиоценку санитарно-б актериолоrическогосостоянияп очвы
п о резу льтатам оп ределения коли-титра, п ерф рингрнс-титра и титра термоф ильных б актерий.
М ет о д ическиеука за ния О пр ед ел ениемикр о бно го числ а по чвы
Почву б еру тнаглу б ине10-15 см стерильным нож ом (из разных мест исследу емой территории не менее 10 п роб ) и п омещ аю т встерильну ю б анку . И з п роб готовятнавеску (30 г), котору ю вносятвколб у с водой (270 мл) и тщ ательно встряхиваю т. И з п олу ченной су сп ензии готовят
разведения l0-3, l0-4, 10-5. И з дву х п оследних разведений б еру т 0,1 мли
смеш иваю т с 40 мл 0,7 % расп лавленного и осту ж енного до 45 °С п итательного агара, п ослечего выливаю твторым слоем вчаш ки Петри с
2% п итательным агаром. Посевы инку б иру ю т п ри 37 °С. Затем п одсчитываю т количество выросш их колоний и оп ределяю т микроб ное
число. |
|
|
|
|
|
О пр ед ел ение ко л и-т ит р а , |
пер фр ингенс-т ит р а |
и |
т ит р а |
т ер мо |
фил ьны х ба кт ер ийпо чвы |
|
|
|
Различные разведения п очвенной су сп ензии засеваю т п о 1 мл в
п роб ирки со средой К есслераи инку б иру ю тп ри 43 °С втечение48 ч. В дальнейш ем анализ п роводят п о схеме, п рименяемой п ри оп ределении коли-титраводы.
Д ля оп ределения п ерф рингенс-титра различные разведения п очвенной су сп ензии п о 1 мл засеваю т в п роб ирки со стерильным об езж иренным молоком или ж елезосу льф итной средой В ильсона-Блера.
Посевы инку б иру ю тп ри 43 °С втечение24 - 48 ч., п ослечегоу читываю т резу льтаты п о свертыванию молокаили п о об разованию черных колоний Сlо stridium р еrfringеns вагаровом столб ике среды В ильсона-Блера. И з
колоний |
делаю т мазки, |
окраш иваю т п о |
Граму , |
микроскоп иру ю т и |
||
вычисляю тп ерф рингенс-титр. |
|
|
||||
Со ст а в ср ед . СредаК есслера: 1 % п еп тона, 5 % ж елчи, 0,25 % |
||||||
лактозы, |
|
|
|
|
для |
п одавления роста |
генциановый |
ф иолетовый |
грамп олож ительных б актерий.
Железосу льф итнаясредаВ ильсона-Блера: 3 % п итательногоагара, 1
%глю козы, 2 % су льф итанатрия, 0,08 % хлоридаж елеза.
Д ля оп ределения титратермоф ильных б актерий разведения п очвенной су сп ензии п о 1 мл вносят вчаш ки Петри, заливаю т расп лавленным и охлаж денным п итательным агаром. Посевы инку б иру ю т втечение су ток
п ри 60 °С, а затем п одсчитываю т количество выросш их колоний и п ересчитываю тна1 гп очвы.
52
Санитарно-микроб иологическу ю оценку п очвы п роизводят п о комп лексу п оказателей, из которых наиб олее важ ным является
установлениестеп ени ф екальногозагрязнения(таб л. 7).
Таблица 7. О ценка санитарного состояния п очвы п о основным микроб иологическим п оказателям
Х арактеристика |
К оли-титр |
Перф рингенс- |
К оличество |
|
|
п очвы |
|
|
титр |
термоф ильных б актерий |
|
|
|
|
|
в1 гп очвы |
|
Ч истая |
|
1,0 и выш е |
0,01 и выш е |
102-103 |
|
Загрязненная |
|
0,9-0,01 |
0,009-0,0001 |
О т103 до104 |
|
Сильно |
|
0,009 иниж е |
0,00009 и ниж е |
О т105 до4х106 |
|
загрязненная |
|
|
|
|
|
Т ема7.4. М |
И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Й К О Н Т РО Л Ь В А ПТ Е К А Х |
|
|||
За д а ниед л я вы по л нения л а бо р а т о р но йр а бо т ы |
|
|
|||
Провести |
микроб иологическое исследование смывов с |
раб очей |
|||
п оверхности |
до и п осле п роведения дезинф екции. Провести |
оценку |
|||
резу льтатов. |
|
|
|
|
|
М ет о д ическиеука за ния
О б ъ ектами б иологических исследований являю тся:
1.В одадистиллированная.
2.И нъ екционныерастворы достерилизации.
3.И нъ екционныерастворы п ослестерилизации.
4.Глазные кап ли, п риготовленные настерильных растворах и п осле стерилизации.
5.Су хие лекарственные вещ ества, исп ользу емые для п риготовления инъ екционных растворов.
6. А п течная п осу да, п роб ки, п рокладки, п рочие всп омогательные материалы.
7.И нвентарь, об ору дование, ру ки и санитарнаяодеж дап ерсонала.
Возду ш наясреда.
О тб ор п роб для исследования п роводят сотру дники санитарноэп идемиологических станций или раб отники б актериологической лаб оратории. К ратность об следований с отб ором п роб составляетнеменее 2-х раз вквартал.
1. Иссл ед о ва ниед ист ил л ир о ва нно йво д ы :
а ) О пр ед ел ение ко л ичест ва мезо фил ьны х а эр о бны х и фа кул ьт а т ивны х
ана эр о бны х ба кт ер ийв 1 см3 д ист ил л ир о ва нно йво д ы .
Исследу ему ю воду вносятп о1 см3 вдвеп араллельныечаш ки Петри, которыезатем заливаю тп итательным агаром и выдерж иваю т24 часап ри
темп ерату ре 37 °С и 24 часап ри комнатной темп ерату ре. |
После этого |
п одп итываю тчисловыросш их колоний как нап оверхности, |
так и вну три |
п итательногоагара. При вычислении резу льтатованализавыводятсреднее ариф метическоеиз числаколоний, выросш их наоб еих чаш ках.
53
б) Дл я вы явл ения пл есневы х и д р о ж ж евы х гр ибо в засеваю т п о 0,5 см3
исследу емой воды нап оверхность дву х чаш ек Петри со средой Саб у ро и
инку б иру ю т п ри темп ерату ре 20 - 22 °С втечение 3 - 4 су ток. Затем п одсчитываю т число колоний п лесневых и дрож ж евых гриб овнаоб еих чаш ках.
Резу льтаты |
оцениваю т п о об щ ему количеству |
неп атогонных |
микроорганизмов, |
п у тем су ммирования числа б актерий выросш их на |
|
чаш ках с п итательным агаром инасредеСаб у ро(ПриказМ |
инздраваСССР |
|
№ 573 от30.11.62, п рилож ение№ 1). |
|
О п ределениетитраб актерий гру п п ы киш ечной п алочки (М етодика действу ю щ егоГосстандарта18963-73 «В одап итьевая, М етоды санитарно-
б актериологическогоанализа» . |
|
|
|
|
|
||
|
2. Иссл ед о ва ние д ист ил л ир о ва нно й |
во д ы |
д л я |
пр иго т о вл ения |
|||
|
|
|
|
|
|||
инъекцио нны х р а ст во р о в и гл а зны х ка пел ь, |
инъекцио нны х |
р а ст во р о в д о |
|||||
ст ер ил иза ции гл а зны х ка пел ь, |
пр иго т о вл енны х в а септ ических усл о виях на |
|
|||||
ст ер ил ьны х о сно ва х |
|
|
|
|
|
|
|
а ) О пр ед ел ение ко л ичест ва |
мезо фил ьны х |
а эр о бо в |
и фа кул ьт а т ивны х |
||||
а на эр о бо в п роизводятвсоответствии с п у нктом 1а. |
|
|
см3. |
||||
б) О пр ед ел ение на л ичия ба кт ер ий гр уппы кишечны х па л о чек в 1,0 |
|||||||
Л екарственные средства засеваю т в количестве 1 |
г (см3) на 9 |
см3 |
|||||
разведенной глю козо-п еп тонной среды, среды К есслер и К ода. Посевы |
выращ иваю тп ри темп ерату ре37 °С втечение18 - 24 часовс дальнейш им
высеном секторами на |
среду Э ндо, п оследню ю инку б иру ю т |
п ри |
|||
темп ерату ре 37 |
°С 18 - |
24 |
часа и п роводят п росмотр п осевов. И з |
||
п одозрительных |
колоний |
делаю т мазки, красят п о |
Граму |
и |
|
микроскоп иру ю т. |
При наличии грамотрицатедьных п алочек, |
оставш у ю ся |
часть колоний п ересеваю т на глю козо-п еп тонну ю среду с п оп лавком,
инку б иру ю тп ри37 °С втечение18 - 24 часов. Н аличиекислоты и газана глю козо-п еп тонной среде об у словливает содерж ание б актерии гру п п ы киш ечных п алочек.
в) Ко л ичест венно ео пр ед ел ениеба кт ер ии гр уппы кишечны х па л о чек. 1 г
(см3) лекарственных средствзасеваю тначаш ку и заливаю тсредой Э ндо, т.е. п рименяю т глу б инный метод п осева. После инку б ации п осевовп ри
темп ерату ре37 °С втечение18 - 24 часову читываю тколонии тип ичные дляб актерий гру п п ы киш ечнойп алочки.
|
3. Иссл ед о ва ние сухих л ека р ст венны х |
вещ |
ест в, |
испо л ьзуемы х |
д л я |
|||||||
пр иго |
т о вл ения инъекцио нны х р а ст во р о в и гл а зны х ка пел ь |
|
|
|
||||||||
|
Резу льтаты п олу ченные п ри исследовании |
су хих лекарственных |
||||||||||
вещ еств слу ж ат |
одним |
из |
оснований |
для |
выб ора |
п артии |
п ри |
|||||
п риготовлении инъ екционных растворов. |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
Су хие |
лекарственные |
вещ ества |
разводят |
стерильной |
|||||||
дистиллированной |
водой |
с |
целью |
создания |
соответству ю щ их |
концентраций инъ екционным растворам и глазным кап лям изготовляемым
54
вап теках. О б ъ ем и методикаисследованияп риготовленных растворовсм. п у нкт2.
Резу льтаты п олу ченные п ри исследовании су хих вещ еств в растворах долж ны соответствовать треб ованиям п рилож ения п риказа№
573, такие ж е треб ования п редъ являю тся к |
глазным |
кап лям, |
п риготовленных васеп тических у словиях настерильнойоснове. |
|
|
4. Иссл ед о ва ния а пт ечно й по суд ы , пр о бо к, пр о кл а д о к, |
во р о но к, |
|
цил инд р о в |
|
|
Т ри одноименных ф лакона, доставленные |
в лаб ораторию , |
п оследовательнооп оласкиваю тв10 см3 стерильной водоп роводной воды. В оду из ф лаконавоф лакон п ереливаю тнадп ламенем горелки, тщ ательно сп оласкиваякаж дый ф лакон.
В б анки или ш ирокогорлые колб ы с доставленными п роб ками и п рокладками наливаю т 10 см3 стерильной водоп роводной воды и тщ ательносп оласкиваю т.
В смы вно йж ид ко ст и пр о во д ят о пр ед ел ение:
а ) ко л ичест ва мезо фил ьны х а эр о бны х и фа кул ьт а т ивно а на эр о бны х ба кт ер ий (см. п у нкт1а). Ч исло колоний, у становленноев1 см3 смывной ж идкости, у множ аю т на10, что соответству ет содерж анию б актерий на всейсмывш и п оверхности 3-х одноименных п редметов;
б) о пр ед ел ение на л ичия ба кт ер ий гр уппы кишечны х па л о чек 8 см3
3
оставш ейся смывной ж идкости засеваю т в 1 мл концентрированной
глю козо-п еп тонной среды и инку б иру ю тп ри темп ерату ре37 °С втечение 18 - 24 часов. Д альнейш ий ход исследованияи идентиф икацию б актерий гру п п ы киш ечных п алочек п роводятп оп у нкту 2б .
Инт ер пр ет а ция р езул ьт а т о в ба кт ер ио л о гических иссл ед о ва ний:
- количество мезоф ильных аэроб ов |
и ф аку льтативных анаэроб ов не |
долж но п ревыш ать 150 колоний с |
3-х ф лаконов, 5-ти п роб ок, 5-ти |
п рокладок (т. е. в10 см3 смывной ж идкости); - б актерии гру п п ы киш ечнойп алочки недоп у скаю тся.
5. М ет о д ика иссл ед о ва ния во зд уха
Д оставленные чаш ки с п осевами на п итательном агаре и Ж СА
инку б иру ю твтермостатеп ри 37 °С втечение24 часов, п осевы наЖ СА доп олнительновыдерж иваю тещ е24 часап ри комнатнойтемп ерату ре.
Посевы насредеСаб у роинку б иру ю тп ри темп ерату ре22 - 28 °С- 4 су ток. Д ля оп ределения об щ ей б актериальной об семененности через 48 часов п осевы п росматриваю т, п одсчитываю т количество выросш их колоний и
п роизводятп ересчетна1 м3.
Д ля оп ределения количественного содерж ання золотистого стаф илококкап росматриваю т п осевы нап осле 48-ми часовинку б ации, колонии п одозрительные на стаф илококк п одсчитываю т и п роводят идентиф икацию . Послеидентиф икации п роизводятп ересчетп олу ченных
55
резу льтатовна1 м3 возду ха(Прилож ение№ 2 к п риказу М инздраваСССР
№720 от31. 07. 78 г.)
Для количественного оп ределения п лесневых и дрож ж евых гриб ов
после96 часовой инку б ации п одсчитываю тколичествовыросш их колоний
плесневых и дрож ж евых гриб овп роизводятп ересчетна1 м3.
6. Иссл ед о ва ниесмы во в
О риентировочный п еречень об ъ ектов, п одлеж ащ их контролю методом смывов:
1.Раб очееместодеф ектара.
2.Столдляп риготовленияинъ екционных растворов.
3.Столдляп риготовленияглазных кап ель.
4.В есы длявзвеш иваниясу хих вещ еству деф ектара.
5.Т арадля хранения п рокладок и п роб ок, исп ользу емых для у ку п орки инъ екционных растворовиглазных кап ель.
6.Сту п ки.
7.Пластинки п ластмассовые.
8.В есы роговые.
9.К ранводоп роводный вассистентской.
10.Ру ки п ерсонала.
11.Полотенце.
12.Санодеж да.
Объем иссл ед о ва ния:
а) оп ределениеб актерий гру п п ы киш ечных п алочек.
Т амп он со стеклянной п алочкой п омещ аю т всреду К есслераили К ода. Д альнейш ий ход исследования и идентиф икацию п роводят п о об щ еп ринятойметодикеисследованиясм. п у нкт1б , в.
б ) оп ределениеп атогенных (золотистых) стаф илококков(п о п оказаниям) осу щ ествляю т п у тем п осевасмывовж идкости вп роб ирку с 5 см3 6,5%
солевого б у льона. |
Д альнейш ий ход исследования п роводят согласно |
п рилож ению № 2 к |
п риказу № 720 от31.07.78 г. |
Инт ер пр ет а ция р езул ьт а т о в:
Бактерии гру п п ы киш ечной п алочки и п атогенные стаф илококки в
смывах недоп у скаю тся. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Т ем а |
8. |
М Е Т О Д Ы |
В Ы Я В Л Е Н И Я |
И |
Т И Т РО В А Н И Я |
||||||
СПЕ Ц И Ф И Ч Е СК И Х А Н Т И Т Е Л |
(СЕ РО Д И А ГН О СТ И К А ) |
|
|||||||||
За д а ния д л я вы по л нения л а бо р а т о р но йр а бо т ы |
|
|
|
||||||||
1. |
Поставить ориентировочну ю |
реакцию |
агглю тинации настекле с |
||||||||
целью |
идентиф икации изу чаемых |
чистых |
ку льту р |
б актерий. |
Сделать |
||||||
заклю чениеп орезу льтатам реакции. |
|
|
|
|
|
|
|||||
2. |
Протоколировать |
и |
оценить резу льтаты |
|
реакции |
неп рямой |
|||||
гемагглю тинации |
(РИ ГА ), |
п оставленной |
с |
целью |
серодиагностики. |
||||||
Сделать заклю чениеп орезу льтатам реакции. |
|
|
|
|
|
56
В сеимму номикроб иологическиеметоды (И М ) мож норазделить на3
гру п п ы: |
|
|
|
|
И М |
, |
основанные п ап рямом взаимодействии антигенас антителом |
||
(ф еномены |
агглю тинации, |
п рецип итации, |
гемагглю тинации, |
|
иммоб илизации и др.); |
|
|
||
И М |
, |
основанные на оп осредованном взаимодействии антигена с |
антителом (реакции неп рямой гемагглю тинации, коагглю тинации, латекс-
агглю тинации, |
у гольной |
аггломерации, |
б ентонит-агглю тинации, |
|
связываниякомп лементаидр.); |
|
|
||
И М с исп ользованием |
меченых антител или |
антигенов (метод |
||
ф лю оресциру ю щ их антител, |
имму ноф ерментный и |
радиоимму нный |
||
анализы, сп инимму нологический и дру гиеметоды). |
|
|||
Р еа кция а ггл ют ина ции (Р А) |
|
|
||
Реакция основана п а взаимодействии |
п оверхностных антигенов |
б актерий и дру гих корп у ску лярных частиц с антителами и п ротекаетвдве
ф азы: 1) |
сп ециф ическая ф аза - |
связывание детерминап тной гру п п ы |
(эп итоп а) |
антигенас п аратоп ом - |
активным центром имму ноглоб у лина |
(невидимая ф аза); 2) несп ециф ическая (видимая) ф азаоб разу ю щ ийся комп лекс (А Г+А Т ) у трачиваетрастворимость и вып адаетвосадок ввиде хлоп ьев. О днако это явление возмож но лиш ь в электролитной среде, нап ример в0,85 % растворенатрияхлорида.
РА мож но п рименять для об нару ж ения сп ециф ических антителв сывороткекрови и, наоб орот, п ри п омощ и стандартной агглю тиниру ю щ ей сыворотки мож ноидентиф ицировать выделенныемикроб ы.
О р иент ир о во чна я Р А д л я ид ент ифика ции микр о ба
Реакция слу ж ит для п редварительного оп ределения видамикроб а. Н ап редметноестекло наносяткап лю у зкосп ециф ичной адсорб ированной сыворотки (т.е. сыворотку , содерж ащ у ю толькосп ециф ическиеантитела). Сыворотку наносят вразведении 1:10 и рядом кап лю ф изиологического
раствора(контроль). И сследу ему ю |
ку льту ру микроб ап етлей вносятвоб е |
||
кап ли и размеш иваю т. Ч ерез 2 |
- 4 мин. |
у читываю т резу льтат. При |
|
п олож ительной реакции |
(соответствие |
исследу емой ку льту ры |
|
диагностической сыворотке) |
наб лю дается ску чивание б актерий ввиде |
хлоп ьевнаф онеп розрачной ж идкости. В контролеравномернаяму ть.
К роме сп ециф ической агглю тинации б актерий, вызванной антителами, возмож насп онтаннаяагглю тинация(вотсу тствиеимму нной сыворотки).
Сп онтанну ю |
агглю тинацию даю т R-ф ормы б актерий, не об разу ю щ ие |
гомогенной |
взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и |
осаж даю щ иесяввидеклеточных агрегатов. При кислой реакции среды в резу льтате снятия одноименного зарядас п оверхности б актериальных клеток визоэлектрической зонетакж еп роисходитсклеиваниенасту п ает
«кислотная» агглю тинация. Ч тоб ы исклю чить возмож ность |
у чета |
лож ноп олож ительных резу льтатов сп онтанной агглю тинации, |
всегда |
ставятконтрольну ю п роб у с изотоническим раствором хлориданатрия.
57
Р еа кция непр ямо йгема ггл ют ина ции
РН ГА являетсясвоеоб разной модиф икацией РА . Су щ ность реакции состоит втом, что молеку лы антигенаадсорб иру ю тся нап оверхности эритроцитов. Т акие"нагру ж енные" антигенами эритроциты п риоб ретаю т сп особ ность агглю тинироватьсяимму нной сывороткой, сп ециф ичной для данногоантигена. Э ритроциты склеиваю тсяи вып адаю твосадок, об разу я
на дне п роб ирки гемагглю тинат. В |
п оследнее время РИ ГА п олу чила |
|
ш ирокое расп ространение б лагодаря высокой |
чу вствительности, |
|
эксп рессивностиип ростотеп остановки. |
|
|
В лу нках п олистироловых п ланш етовготовятрядп оследовательных |
||
дву кратных разведений сыворотки. В |
п редп оследню ю |
лу нку вносят- 0,5 |
мл заведомо п олож ительной сыворотки и в п оследню ю 0,5 мл ф изиологического раствора(контроль). Затем во вселу нки доб авляю тп о
0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностику ма, |
встряхиваю т и |
||||||||||||
п омещ аю т в термостат на 2 ч. В |
п олож ительном |
слу чае эритроциты |
|||||||||||
оседаю т надне лу нки ввиде ровного слоя клеток |
со складчатым или |
||||||||||||
зазу б ренным краем (п ереверну тый зонтик), |
вотрицательном - оседаю тв |
||||||||||||
видеп у говки иликолечка(таб л. 8). |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Т аблица 8. Постановкареакции неп рямойгемагглю тинации |
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
И нгридиенты |
|
|
Н омералу нок п анели |
|
К онтроли |
||||||||
|
|
|
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
5-я |
1-й |
|
2-й |
|
||
И зотонический |
|
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
0,5 |
|
0,5 |
- |
|
0,5 |
|
|
раствор |
натрия |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
хлорида, мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
И сследу емая |
|
0,5→ |
0,5→ |
0,5→ |
0,5→ |
0,5− |
И мму нный |
|
|
||||
сыворотка |
|
в |
|
|
|
|
|
|
|
диагностику м |
|
|
|
разведении |
1:25, |
|
|
|
|
|
|
|
0,5 |
|
|
|
|
мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Полу ченное |
|
1:50 |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
|
|
|
|
|||
разведение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
сыворотки |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Э ритроцитарный |
|
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
0,1 |
|
0,1 |
0,1 |
|
0,1 |
|
|
диагностику м, мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
И нку б ацияп ри 37 °Свтечение2ч. втермостате |
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Т итр сыворотки 1:100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Н аэритроцитах мож но адсорб ировать не только антигены, но и |
|||||||||||||
антитела. В |
данном слу чае РН ГА |
мож но п рименять для индикации |
|||||||||||
п атогенных |
микроб ов во внеш ней |
среде. |
Д ля этого IgG сыворотки |
||||||||||
ф иксиру ю т |
п а |
п оверхности |
б араньих |
эритроцитов. |
Разреш аю щ ая |
сп особ ность эксп ресс-индикации антигеновсоставляет несколько тысяч микроб ных телв1 мл.
58
Реа кция пр еципит а ции в гел е
Имму нодиф ф у зия вагаровом геле растворовантигенови антител, залитых вразныелу нки, навстречу дру гдру гу вслу чаях соответствияих
сп ециф ичности п риводит к об разованию сп ециф ического п рецип итатав
видеп олосок и ду гвместах встречи реагентов. |
|
|
К ак п равило, вцентральну ю |
лу нку заливаю т стандартный раствор |
|
антигена, а в п ериф ерические - |
исп ыту емые сыворотки. В |
одну из |
п ериф ерических лу нок заливается стандартная имму нная |
сыворотка |
соответству ю щ ей сп ециф ичности, авдру гу ю - нормальнаясывороткадля
контроля. Проводитсяинку б ациявовлаж ной камереп ри 37 °С втечение 24 ч. У читываю т количество и ш ирину п олос п рецип итации меж ду центральной лу нкой с раствором антигенаи лу нками с исследу емыми сыворотками.
Р еа кция л изиса . Р еа кция связы ва ния ко мпл емент а
Д ляп остановки реакции лизисаи реакции связываниякомп лемента (РСК ) исп ользу ю т комп лемент, который содерж ится всыворотке крови морских свинок. Гемолитическаяактивность комп лементатермолаб ильна и п олностью у трачиваетсяп ри п рогревании сыворотки втечение30 мин.
п ри 56 °С. При адсорб ции комп лементанакомп лексеантиген - антитело его действие п роявляется реакцией лизиса антигена, если антиген
корп у ску лярный, |
или |
не соп ровож дается никакими видимыми |
изменениями, еслиэтомелкодисп ерсныеилирастворимыеантигены. |
||
Д ляу четарезу льтатовРСК вводятвсп омогательну ю (индикаторну ю ) |
||
гемолитическу ю |
систему . |
О насостоит из взвеси эритроцитовб аранав |
изотоническом растворе хлориданатрия и гемолитической сыворотки кролика, п олу ченной п у тем егоимму низации у п омяну тыми эритроцитами. Полож ительная РСК характеризу ется задерж кой гемолиза вследствие адсорб ции комп лементасистемой антиген - антитело. О трицательнаяРСК характеризу ется наличием гемолиза, п оскольку своб одный комп лемент связывается с системой эритроциты б аранагемолитическая сыворотка кролика. РСК об ладает высокой чу вствительностью и сп ециф ичностью , чтоп озволяетисп ользовать еедлясеродиагностики многих заб олеваний.
Д ляп остановки РСК треб у етсяточноеоп ределениеколичественных соотнош ений всех ингредиентов, у частву ю щ их вреакции: исследу емой сыворотки, антигена, комп лемента, гемолитической сыворотки кроликаи эритроцитовб арана. Поэтому п остановкеосновного оп ытап редш еству ет титрование гемолитической сыворотки и выб ор ее раб очего разведения,
титрованиедру гих ингредиентов. |
|
|
|
|||
|
П р иго т о вл ениеи т ит р о ва ниеингр ед иент о в д л я Р СК |
|
||||
|
|
|
|
|||
|
Тит р о ва ниеко мпл емент а . |
Д ля оп ределения титраи раб очей дозы |
||||
п роизводят титрование комп лемента с п омощ ью |
реакции имму нного |
|||||
гемолиза. Д ля |
этого свеж у ю |
сыворотку морской свинки |
разводят |
|||
изотоническим |
раствором хлорида натрия от 1:10 |
до 1:40. К |
0,2 мл |
|||
каж дого разведения комп лементадоб авляю т п о 0,4 |
млгемолитической |
59
смеси (смеси равных об ъ емов3 % су сп ензии эритроцитоввизотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки в разведении,
соответству ю щ ем еетройному титру ). Проб ирки выдерж иваю тп ри 37 °С и через 30 мин. оп ределяю т титр комп лементанаиб ольш ееразведение комп лемента, котороевызываетп олный лизис эритроцитоввп рису тствии гемолитической сыворотки. Раб очу ю дозу комп лементарассчитываю т, исходяиз его титра. Раб очаядозакомп лементадолж наб ыть выш етитра на25 %. Т ак, нап ример, п ри титрекомп лемента1:20 вкачествераб очей дозы б еру тегоп редыду щ ееразведение1:10.
Ант игены изготавливаю тсяиз взвесей у б итых микроорганизмов, их лизатов, п олных антигенов, гап тенов, экстрактовтканевых лип идов.
Взвесьэр ит р о цит о в б аранап олу чаю тиз деф иб ринированной крови б арана, отмываяэритроциты изотоническим раствором хлориданатриядо п олу ченияп олнойб есцветностиип розрачностинадосадочной ж идкости и готовятиз них 3 % взвесь визотоническом растворехлориданатрия.
Гемо л ит ическа я сы во р о т ка |
готовится |
п у тем 3-4-кратной |
вну тривенной имму низации кролика50 % взвесью |
б араньих эритроцитов |
и инактивиру етсяп ри 56 °С (разру ш ен комп лемент). Н аэтикеткеамп у лс сывороткой об означен ее титр - максимальное разведение данной сыворотки, котороеоб есп ечиваетп олный лизис 3 % взвеси эритроцитов
б аранавп рису тствии комп лементап ри 37 °С втечение часа. Д ля РСК
беру тгемолитическу ю сыворотку втройном титре.
По ст а но вка о сно вно г о о пы т а Р СК
Послеу становления титраи раб очих доз всех ингредиентовставят основной оп ыт РСК . И сп ыту ему ю и контрольные сыворотки
п редварительно инактивиру ю тнагреванием п ри 56 °С втечение30 мин. Стандартная схемап остановки РСК п реду сматриваетп роведение п ервой ф азы инку б ации смеси антигенаисп ыту емой сыворотки и комп лемента
п ри 37 °С втечение 30 мин. При п остановке РСК нахолоде эту ф азу п роводятп ри 0 - 4 °С втечение18 - 20 ч., чтоп овыш аетчу вствительность реакции.
После доб авления вкаж ду ю п роб ирку п о 0,4 млгемолитической
системы п роб ирки встряхиваю ти выдерж иваю т20 - 30 мин. п ри 37 °С. Резу льтаты оп ытаоцениваю т, отмечаяналичиеилиотсу тствиегемолизаво всех п роб ирках.
Реакцию считаю т п олож ительной п ри п олной задерж ке гемолиза, когдаж идкость вп роб ирке б есцветнаи эритроциты оседаю т надно, отрицательной - п ри п олном лизисе эритроцитов, когда ж идкость интенсивно окраш ена («лаковая кровь» ). Степ ень задерж ки гемолиза оцениваю твзависимости отинтенсивности окраски ж идкостиивеличины осадкаэритроцитовнадне( + + + + , + + + , +).
В качестве контроля (2-я и 3-я п роб ирки) у читываю т реакцию с заведомо п олож ительной и заведомо отрицательной сыворотками; 4-яи
60
5-я п роб ирки слу ж ат для п роверки антикомп лементарных свойств сыворотки и антигена; в6-й и 7-йп роб ирках контролиру ю тсяраб очаядоза комп лементаикачествогемолитическойсистемы.
Р еа кция Кумбса
Слож ность выявлениянеп олных (моновалентных) антителсвязанас тем, чтоэти антитела, связываясь с эп итоп ами сп ециф ическогоантигена,
не об разу ю т стру кту ру реш етки и реакция |
меж ду антигенами |
и |
антителами не выявляется ни агглю тинацией, |
ни п рецип итацией, |
ни |
дру гими тестами. Д ля выявления об разовавш ихся комп лексовантиген - антитело п риходится исп ользовать доп олнительные тест-системы. Д ля выявления неп олных антител, нап ример к резу с-антигену эритроцитовв сывороткекрови б еременной ж енщ ины, реакцияставитсявдваэтап а: I) к дву кратным разведениям исп ыту емой сыворотки доб авляю тэритроциты,
содерж ащ иерезу с-антиген, и выдерж иваю тп ри 37 °С втечениечаса; 2) к
тщ ательно |
отмытым п осле |
п ервого: этап а эритроцитам |
доб авляю т |
кроличью |
античеловеческу ю |
антиглоб у линову ю сыворотку |
(в заранее |
оттитрованном раб очем разведении). Послеинку б ации втечение30 мин.
п ри 37 |
°С резу льтаты |
оцениваю т п о наличию |
гемагглю тинации |
|||
(п олож ительная реакция). |
Н еоб ходимо ставить контроль ингредиентов |
|||||
реакции: |
1) |
антиглоб у линовая |
сыворотка |
+ |
заведомо |
|
сенсиб илизированные сп ециф ическими |
антителами |
эритроциты; 2) |
об раб отанные нормальной сывороткой эритроциты -f- антиглоб у линовая
сыворотка; |
3) об раб отанные исследу емой сывороткой резу с- |
отрицательныеэритроциты + антиглоб у линоваясыворотка. |
|
Иммуно фер мент ны йа на л из |
|
О дним |
из наиб олее чу вствительных методов выявления антител |
считается имму ноф ерментный анализ (И Ф А ), который не у сту п ает п о чу вствительности радиоимму нному анализу (РИ А ) и в то ж е время отличаетсяотнегоб ольш ей досту п ностью дляоб ычных диагностических лаб ораторий. Сп ециф ический антиген адсорб иру ю тнап оверхности лу нок в п ластинах из п олистирола (п оливинилхлорида). Ф иксированный на
п ластине антиген инку б иру ю т с исп ыту емыми |
человеческими |
сыворотками. После отмывания от несвязавш ихся б |
елков связанные |
иммоб илизованными антигенами имму ноглоб у лины выявляю тс п омощ ью антивидовой (античеловеческой) антиимму ноглоб у линовой сыворотки, к антителам которой ковалентно п рикреп лен ф ермент-п ероксидаза. После
инку б ации с |
су б стратом (п ероксидом |
водорода) и индикатором |
|
(диаминоб ензидином) оцениваю т ф ерментативну ю |
активность п о |
||
интенсивности |
окраски. И нтенсивность |
окраски, |
п роп орциональну ю |
количеству сорб ированных наантигенеантител, мож нооценить визу ально или с п омощ ью сп ектроф отометра. В данной модиф икации у доб на у ниверсальность меченогореагента, который п озволяетвыявлять антитела к разным антигенам.