Казимирский А.Н. - Биоокисление

клеточными) медиаторами гормонального сигнала. Как субстраты жирные кислоты претерпевают обычный цикл катаболитических превращений. Они активируются во внешней мембране митохондрии, давая ацил-СоА. Полученные жирные ацилы транспортируются в митохондриальный матрикс посредством карнитиновой системы, где расщепляются, давая СО2 и восстановительные эквиваленты, под действием ферментов β-окисления.

9. Восстановительные эквиваленты, поставляемые в дыхательную цепь при β-окислении жирных кислот и окислении ацетильных групп в цикле Кребса, переносятся к О2, что сопряжено с образованием воды и тепла.

Бурая жировая ткань важна животным, впадающим в спячку. Во время зимней спячки температура тела и скорость метаболизма падают, сохраняя запасы пищи. Пробуждение от спячки осуществляется генерацией тепла бурой жировой тканью. Крупные взрослые млекопитающие, в том числе люди, обычно не имеют проблем с производством тепла, поскольку отношение массы тела (генерирующей тепло) к площади его поверхности (теряющей тепло) приводит к выработке лишнего тепла, поэтому у взрослых людей наоборот развиваются механизмы предохранения от перегревания – потоотделение, расширение капилляров кожи. Нет данных о том, что у взрослых людей имеется достаточное количество бурой жировой ткани. Напротив, у детей соотношение массы к площади поверхности совсем другое и им необходимы дополнительные механизмы теплопродукции, у новорожденных бурый жир играет важную роль. Затем он исчезает в процессе развития. Имеются противоречивые сведения о том, может ли он регенерировать и возобновить свою работу у взрослых, или же белая жировая ткань не может превратиться в бурую.

У взрослых людей жировая ткань вся относится к типу белой. Ее основная метаболическая роль заключается в контролировании процесса запасания и высвобождения жира, запасания в форме триацилглицеидов и высвобождения в виде жирных кислот. Жировую ткань иногда описывают как метаболически инертную: она потребляет мало кислорода, однако следует учитывать, что транспорт жирных кислот внутрь и наружу из белой жировой ткани представляет собой важную часть энергетического метаболизма.

Возрастная характеристика энергетического обеспечения организма питательными веществами.

В первые часы после рождения у ребенка источником энергии служит аминокислота аланин и лактат, из которых путем глюконеогенеза образуется глюкоза. Но все же их недостаточно как энергетических источников энергии, поэтому основным поставщиком энергии от рождения до начала кормления материнским молоком являются липиды. До прикладывания ребенка к груди у новорожденного активизируется липолиз, мобилизуется жир из депо. Гидролизуются триацилглицериды липопротеинов плазмы крови, и в крови новорожденных повышается количество жирных кислот, глицерина, кетоновых тел. Интенсивно окисляются жирные кислоты в тонком кишечнике, сердце,

51

корковом слое почек. Окисление жирных кислот дает большую энергию по сравнению с глицерином. Глюкоза и кетоновые тела являются источником энергии для сердца, головного мозга, периферической нервной системы. Кетоновые тела подавляют липолиз и тем самым предупреждают чрезмерное повышение концентрации жирных кислот. Мозг новорожденного потребляет кетоновые тела в 3-4 раза интенсивнее, чем у взрослых.

После начала кормления материнским молоком в организм новорожденного начинают поступать жиры, углеводы, аминокислоты. Жиры служат главным источником энергии. Причем мозг использует кетоновые тела, которые образовались из жирных кислот, как источник энергии. Липиды материнского молока образуются из триацилглицеридов плазмы крови, а также из глюкозы через пируват до ацетил-СоА. Липиды материнского молока находятся в эмульгированной форме и легко расщепляются. Поэтому молоко матери усваивается на 95-98%. Причем надо отметить, что в молоке матери присутствует 63,5% ненасыщенных жирных кислот (олеиновой и линолевой) и 36,5% насыщенных.

Поступившие в клетку в виде триацилглицеридов липиды расщепляются тканевой липазой, которая очень активна в тканях сердца, стенки аорты, легких, селезенки. В жировой ткани липазы максимально активны к первому месяцу жизни. Триацилглицериды распадаются на глицерин и жирные кислоты. Глицерин превращается в дигидроксиацетонфосфат и далее распадается по пути гликолиза, что дает возможность синтезироваться определенному количеству АТФ. Жирные кислоты подвергаются окислению, что также дает возможность образовываться большому количеству АТФ, в зависимости от длины цепи жирной кислоты. К 1 – 3-х месячному возрасту активность этих процессов возрастает, так как развивающийся организм тратит много энергии, активность окисления углеводов в этот период снижена. В дальнейшем окисление жирных кислот постепенно снижается (например, в сердце в 2-3 раза).

После рождения ребенка усиливается анаэробный распад гликогена, запас которого очень быстро истощается, а уровень лактата повышается в 7-8 раз. В работу включается глюконеогенез, но этот процесс работает не в полную силу. В материнском молоке присутствует лактоза, а также моно – и олигосахариды. В слизистой тонкого кишечника новорожденного синтезируется фермент лактаза, который расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу. Они легко всасываются, и кровью доставляются в печень, где происходит их взаимопревращение. Галактоза, фруктоза превращаются в глюкозу. Глюкоза встает на путь анаэробного гликолиза. У новорожденных этот процесс на 30-35% более активен, чем у взрослых. Аэробный гликолиз имеет место в головном мозге, коре надпочечников. Большое количество лактата (продукт анаэробного гликолиза) приводит к развитию ацидоза, который стимулирует глюконеогенез. Низкая энергетическая эффективность анаэробного гликолиза стимулирует утилизацию глюкозы в пентозном цикле, который в этот период через трансдегидрогеназную реакцию активно работает на

52

выработку энергии, а не только на синтетические процессы. НАДФН(Н+) + НАД+ –(трансдегидрогеназа)→ НАДФ+ + НАДН(Н+).

По мере роста ребенка в рацион включаются соки, фрукты, овощи, являющиеся источниками сахарозы, мальтозы, клетчатки, крахмала. Соответственно начинают синтезироваться и другие ферменты желудочнокишечного тракта, которые расщепляют полисахариды. Увеличивается проницаемость клеточных мембран слизистой кишечника, что способствует проникновению в кровь и дисахаридов. К 7 - 8 месяцу жизни ребенка тормозится пристеночное пищеварение и активизируется полостное, чем и диктуется необходимость введения прикорма — в начале в виде соков.

АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС

Образование токсических форм кислорода, их значение для организма, механизм их повреждающего действия на клетки, механизмы их обезвреживания. Прооксиданты и антиоксиданты.

Несмотря на то, что аэробные организмы для своей жизнедеятельности нуждаются в молекулярном кислороде (О2), при повышении его концентрации выше, чем в атмосферном воздухе, он может проявлять токсические свойства, причем степень токсичности неодинакова для разных видов животных и разных возрастных состояний, зависит от среды обитания и других факторов. Кислород – потенциально опасное вещество. Молекулярный кислород О2 и кислород в составе молекулы Н2О – стабильные соединения. Полное восстановление кислорода происходит на заключительной стадии митохондриального окисления. Химические соединения, в составе которых кислород имеет промежуточные степени окисления, имеют высокую реакционную способность и называются активными формами кислорода.

Эти соединения образуются:

–в монооксигеназных реакциях – супероксид анион-радикал, который может отщепляться от активного центра цитохрома Р450;

–в оксидазных реакциях – образуется пероксидный анион (присоединяя протоны, превращается в перекись водорода);

- в дыхательной цепи митохондриального окисления может происходить утечка электронов от каких-либо переносчиков – это явление наблюдается при реоксигенации ишемических тканей.

Активные формы кислорода могут легко переходить друг в друга.

Донорами электронов могут являться металлы переменной валентности.

Активные формы кислорода являются высокотоксичными продуктами. Они образуются в процессе активирования или частичного восстановления кислорода. Большинство потенциально опасных эффектов кислорода связано именно с образованием его активных форм, действующих как прооксиданты, т.е. обладающих окислительным потенциалом.

53

Супероксид анион-радикал ∙О2- (супероксид, супероксидный радикал), перекись водорода Н2О2 и гидроксильный радикал НО∙ могут образовываться в клетках и тканях организма человека и животных и вызывают оксидативный стресс. Оксидативным (окислительным) стрессом называют процесс повреждения клетки в результате реакций окисления. С химической точки зрения оксидативный стресс представляет собой значительное увеличение клеточного редокс-потенциала или существенное снижение восстановительной способности клеточных редокс-пар, таких как окисленный/восстановленный глутатион. Эффект оксидативного стресса зависит от силы его выраженности. Клетки могут вернуться в исходное состояние при небольших нарушениях. Однако более выраженный оксидативный стресс вызывает клеточную смерть.

Наиболее опасная часть оксидативного стресса - это образование активных форм кислорода (АФК), в которые входят свободные радикалы и пероксиды.

Молекулярный кислород в основном состоянии – бирадикал (∙О-О∙, ∙О2∙) два неспаренных электрона которого располагаются на «разрыхляющих» молекулярных π-орбиталях. Реакционнная способность кислорода резко возрастает при последовательном четырехэлектронном восстановлении молекулы кислорода с образованием в конечном счете 2-х молекул воды.

∙О2∙ + е → ∙О2- диоксид (супероксид анион-радикал) ∙О2- + Н+ → НО2∙ гидропероксид радикал (гидродиоксид) ∙О2- + е → О22- пероксид-анион О22- + 2Н+ → Н2О2 пероксид водорода

Н2О2 + е → ОН- + НО∙ гидроксид-радикал НО∙ + е → ОН- гидроксид-анион

2ОН- + 2Н+ → 2Н2О вода — нетоксичный продукт

Часто в биологических системах роль доноров электронов выполняют ионы металлов с переменной степенью окисления, например, железа или меди:

Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + НО∙ + ОН-

Реакция Фентона, в результате которой образуется основная масса гидроксильных радикалов НО∙ в живых системах.

Из АФК наименее реактивен диоксид (супероксид), который спонтанно или в присутствии переходных металлов превращается в более агрессивные (гидроксильный радикал и др.), что может вызвать повреждение многих клеточных компонентов - липидов, ДНК и белков (как результат их окисления) с образованием различных органических свободных радикалов. Супероксид легко протонируется, превращаясь в слабую кислоту – гидродиоксид, которая легко проникает в липидную фазу клеточных мембран и может непо-

54

средственно реагировать с полиненасыщенными жирными кислотами. Считается, что повреждающее действие обеих форм диоксида незначительно. Большинство АФК постоянно образуются в клетке, но их уровень в норме настолько небольшой, что клетка либо инактивирует их с помощью антиоксидантной системы, либо заменяет повреждѐнные молекулы. Таким образом АФК, образующиеся в качестве побочных продуктов нормального клеточного метаболизма (в основном из-за небольшой утечки электронов в дыхательной цепи митохондрий, а также других реакций в цитоплазме), не вызывают повреждения клетки. Наиболее вероятными участками образования диоксида на электронотранспортной цепи митохондрий считаются два: между коэнзимом Q и цитохромом b, и между ФМН и серусодержащими белками комплекса I. Небольшое количество диоксида может образовываться при окислении гемоглобина до метгемоглобина: Hb-Fe2+ + O2 →MetHb-Fe3+ + ∙О2-

Диоксид и его протонированная форма не представляют существенной опасности для клетки, так как быстро устраняются с помощью фермента су-

пероксидисмутазы.

Пероксид водорода не является радикалом и, будучи нейтральной молекулой, легко проникает через гидрофобные мембраны. Токсические эффекты перекиси водорода проявляются при концентрации более 5х10-5, которая наблюдается в очагах воспаления благодаря активации фагоцитирующих клеток. Пероксид водорода занимает особое место в генерации АФК в лейкоцитах для уничтожения инфицирующих микроорганизмов. Н2О2 в присутствии миэлопероксидазы и перксидазы эозинофилов служит источником гипогалогенидов (например, HClO), которые тоже токсичны и подавляют мик-

рофлору: HCl + Н2О2 → HClO + H2O

В организме пероксид водорода постоянно разрушается за счет фер-

ментов каталазы (2Н2О2 → 2Н2О +О2) и пероксидазы (SH2 + Н2О2 → S + 2H2O).

Свободно проникая внутрь клетки, перокисид водорода взаимодействует с ионами металлов (железо, медь), в результате чего образуется гид- роксид-радикал (гидроксильный радикал) НО∙ :

Н2О2 + Cu+ → Cu2+ + ОН- + НО∙

Кроме того, гидроксильный радикал может образовываться при взаимодействии перекиси водорода с диоксидом:

Н2О2 + ∙О2- → ОН- + НО∙ + О2 Гипохлорит также может быть источником гидроксид-радикала:

HClO + Fe2+ → НО∙ + Cl- + Fe3+ HClO + ∙О2- → НО∙ + O2 + Cl-

Гидроксид-радикал очень активен и инициирует три типа реакций:

55

а) отрыв атома водорода: НО∙ + CH2R2 → H2O + ∙CHR2, к такому типу реакций относятся взаимодействия гидроксидрадикалов с ненасыщенными жирными кислотами в молекулах липидов, инициирующие пероксидное окисление липидов в биомембранах, с рибозой и дезоксирибозой в составе нуклеиновых кислот, лежащие в основе мутагенного действия гидроксидрадикалов.

б) гидроксилирование ароматических соединений: НО∙ + С6Н6 → ∙С6Н5ОН, к этому типу относятся взаимодействия гидроксид радикалов с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеиновых кислот. В частности присоединение НО∙ к молекуле тимина может привести к нарушению комплементарности оснований в ДНК и вызвать мутацию.

в) перенос электрона: НО∙+ Cl- → ОН- + Cl∙ с образованием различных свободных радикалов, вовлекающих в процесс новые молекулы по типу цепной реакции.

Свободный радикал — частица, обладающая одним или несколькими неспаренными электронами Свободные радикалы и различные активные формы кислорода могут образовываться либо при нормальных, основных метаболических процессах, либо под воздействием внешних источников.

Гидроксид-радикал является главным инициатором пероксидного окисления липидов (ПОЛ). Если обозначить липидную молекулу LH, где Н

– водород, принадлежащий СН2-группе полиненасыщенной жирной кислоты, то реакцию можно записать следующим образом:

1.НО∙ + LH → H2O + L∙

2.L∙ + O2 → LOO∙ Возникший пероксидный радикал может вступить во взаимодействие с новым остатком полиненасыщенной жирной кислоты, при этом образуется гидроперекись липида и новый липидный радикал L1∙ :

3.LOO∙ + L1H → L1∙ + LOOH

Чередование последних двух реакций (2 и 3) приводит к вовлечению в процесс все новых молекул липидов и кислорода, что обеспечивает цепной характер процесса.

В отличие от диоксида и перекиси водорода для защиты от гидроксидрадикала нет специфических ферментных систем. Биологические структуры от него защищают такие легко окисляющиеся субстраты, как урацил, мочевая кислота, глюкоза, салицилаты и другие. В последнее время на роль специфического антиоксиданта для НО∙ предполагается мелатонин.

Синглетный кислород — метастабильное состояние молекулярного кислорода (1О2) с более высокой энергией, чем в основном, триплетном состоянии. Он образуется при изменении спина одного из электронов, находящихся на разрыхляющей молекулярной орбитали (2рπ*) молекулы кислорода. В результате спаривания электронов на разрыхляющей орбитали связь между атомами ослабевает. Поэтому синглетный кислород обладает высокой

56

реакционной способностью и легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями, участвует в инициации ПОЛ, в окислении белков и полипептидов, ингибирует Са2+-АТФазу. Образуется во многих ферментативных реакциях и в реакциях с активными формами кислорода как сопутствующий продукт, в частности, в каталазной реакции около 0,5% образующегося кислорода находится в синглетном состоянии. Эффективными ингибиторами синглетного кислорода являются каротиноиды, терпеноиды, карнозин и фенольные антиоксиданты – токоферол, убихинон и другие. Так молекула β-каротина может инактивировать около 1000 молекул синглетного кислорода прежде чем подвергнется окислительной деструкции.

Уровень АФК, превышающий защитные возможности клетки, вызывает серьѐзные клеточные нарушения (например, истощение АТФ) и как результат, разрушение клетки. В зависимости от силы окислительного стресса клетки могут погибнуть в результате апоптоза, когда внутреннее содержимое клетки успевает деградировать до нетоксичных продуктов распада, или в результате некроза, когда сила оксидативного стресса слишком велика. При некрозе клеточная мембрана нарушается и содержимое клетки высвобождается в окружающую среду, что может в результате повредить окружающие клетки и ткани.

Некоторые активные формы кислорода в живых организмах

Некоторые источники свободных радикалов

Курение Ионизирующее излучение Ультрафиолетовый свет

Некоторые лекарства, реагенты и промышленные растворители Загрязнение окружающей среды

Если свободные радикалы не инактивированы, то они могут повреждать все типы клеточных макромолекул, включая белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты, приводя к повреждению клетки. С другой стороны, местное образование таких частиц иммунными клетками (фермент НАДФНоксидаза нейтрофилов) может быть важным фактором в борьбе организма с бактериями и защите его от инфекции.

57

НАДФН + 2О2 → НАДФ+ + 2∙О2- + H+

Активные формы кислорода опасны для клетки, поэтому существуют защитные механизмы (например, в фагоцитах количество образовавшегося пероксида водорода увеличивается только в момент фагоцитоза). Инактивация активных форм кислорода в клетках происходит под действием антиоксидантной системы.

Ферментативные компоненты антиоксидантной системы.

1.Каталаза - геминовый фермент, содержащий Fe3+, катализирует реакцию разрушения перекиси водорода. При этом образуется вода и молеку-

лярный кислород: 2Н2О2 → H2O + O2 Каталазы много в эритроцитах - там она защищает гем гемоглобина от окисления.

2.Супероксиддисмутаза (СОД) катализирует реакцию обезвреживания двух молекул супероксид-аниона, превращая одну из них в молекулярный кислород, а другую - в пероксид водорода (менее сильный окислитель, чем супероксид-анион):

•О2 + •О2+ 2Н+ → H2O2 + O2

СОД работает в паре с каталазой и содержится во всех тканях.

3. Пероксидаза - геминовый фермент, восстанавливает пероксид водорода до воды, но при этом обязательно идет окисление другого вещества, которое является восстановителем. В организме человека таким веществом чаще всего является глутатион - трипептид: γ-глутамил-цистеил-глицин. Эту пероксидазу человеческого организма называют глутатионпероксидаза. SHгруппа цистеина, входящего в состав глутатиона, может отдавать всего 1 атом водорода, а для пероксидазной реакции необходимы 2 атома. Поэтому молекулы глутатиона работают парами. Реакция, катализируемая глутатионпероксидазой:

2Н2О2 + 2Г-SH → H2O + Г-S-S-Г

Регенерация глутатиона идет с участием НАДФН, катализирует ее фермент глутатионредуктаза.

Г-S-S-Г + НАДФН(Н+) → 2Г-SH + НАДФ

Глутатион постоянно поддерживается в восстановленном состоянии в эритроцитах, где он служит для защиты гема гемоглобина от окисления.

Неферментативные компоненты антиоксидантной системы

1. Витамины Е (токоферол) и А (ретинол), каротиноиды и изопреноиды, которые находятся в составе клеточных мембран.

2.Церулоплазмин - белок плазмы крови, который принимает участие в транспорте меди

3.Мочевая кислота.

Механизм действия этих компонентов:

58

они принимают неспаренные электроны от активных форм кислорода, при этом образуется радикал антиоксиданта, который малоактивен. Таким образом неферментативные компоненты антиоксидантной системы — это перехватчики неспаренных электронов.

Итак, антиоксидантная защита состоит из ферментов, водо- и жирорастворимых веществ.

Линия ферментативной защиты включает глутатионпероксидазы, СОД (супероксиддисмутазу) и каталазу. СОД – это семейство антиоксидантных ферментов, катализирующих разложение ∙О2- на Н2О2 и О2. Глутатионпероксидаза содержит селен и восстанавливает гидропероксид, образующийся при окислении жира. Каталаза – это специфический фермент, катализатор расщепления Н2О2.

Вторая линия защиты состоит из низкомолекулярных соединений, например витаминов Е и С, каротиноидов, изопреноидов и так называемых непищевых антиоксидантов, например, фенольных и полифенольных соединений.

Синергичное действие водорастворимых и жирорастворимых клеточных антиоксидантов

Окислительный (оксидативный) стресс может быть определен как не-

устойчивое состояние между прооксидантами и антиоксидантами. Прооксидантные элементы включают все факторы, которые играют активную роль в повышенном образовании свободных радикалов или других активных форм кислорода. В этом процессе могут участвовать как клеточные (дефекты в митохондриальном дыхании, специфические ферменты), так и экзогенные факторы (курение, полиненасыщенные жирные кислоты, загрязнение воздуха, лекарства и т. д.).

Антиоксиданты (антиокислители) — ингибиторы окисления, природные или синтетические вещества, способные тормозить окисление органических соединений активными формами кислорода.

59

Окисление углеводородов, спиртов, кислот, жиров и др. кислородом воздуха представляет собой цепной процесс. Такие цепные реакции осуществляются с участием активных свободных радикалов — пероксидных (RO2٠), алкоксидных (RO٠), алкильных (R٠). Для цепных разветвленных реакций окисления характерно увеличение скорости в ходе превращения (автокатализ). Это связано с образованием свободных радикалов при распаде промежуточных продуктов — гидроперекисей и др.

Механизм действия наиболее распространѐнных антиоксидантов (ароматические амины, фенолы, полифенолы, нафтолы, изопреноиды, каротиноиды и др.) состоит в обрыве реакционных цепей: молекулы антиоксидантов взаимодействуют с активными радикалами с образованием малоактивных радикалов. Окисление замедляется также в присутствии веществ, разрушающих гидроперекиси (диалкилсульфиды и др.). В этом случае падает скорость образования свободных радикалов. Даже в небольшом количестве антиоксиданты уменьшают скорость окисления, поэтому в течение некоторого периода времени (период торможения, индукции) продукты окисления не обнаруживаются. При торможении окислительных процессов большое значение имеет явление синергизма — взаимного усиления эффективности антиоксидантов в смеси, либо в присутствии других веществ.

МИКРОСОМАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Микросомальное окисление — совокупность реакций первой фазы биотранформации ксенобиотиков и эндогенных соединений, катализирующихся ферментными системами мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов при участии цитохрома Р-450. На его долю приходится 5-10 % кислорода, поступающего в организм. АТФ во внемитохондриальном окислении никогда не образуется. При дифференциальном центрифугировании эндоплазматический ретикулум оказывается в микросомальной фракции, поэтому эти реакции получили название микросомальных, а соответствующие ферменты — микросомальных оксигеназ. Суть реакций заключается в гидроксилировании вещества типа R-H с использованием одного атома молекулы кислорода О2, второй атом соединяется с протонами (H+) с образованием воды. Донором протонов является восстановленный НАДФН . Таким образом, меняется структура исходного вещества, а значит и его свойства. Гидроксилирование позволяет перейти процессу обезвреживания вредных продуктов метаболизма во вторую фазу — к реакциям конъюгации, в ходе которых к созданной функциональной группе будут присоединяться другие молекулы эндогенного происхождения.

Уравнение реакции гидроксилирования:

RH + O2 + НАДФН + H+ → ROH + H2O + НАДФ+

Существуют 2 типа внемитохондриального окисления:

60