диссертации / 97
.pdfФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
(ИБХ РАН)
________________________________________________________________
На правах рукописи
Бойко Анна Александровна
ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА
70 КДА И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПРОДУКЦИЕЙ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ СТАРЕНИИ
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Коваленко Елена Ивановна
Москва, 2015 г.
СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений……………………………………………………………..5
Введение…………………………………………………………………………..8
I. Обзор литературы……………………………………………………………10
1.1.Нейтрофилы, их характеристика…………………………………………...10
1.1.1.Нейтрофильные гранулы……………………………………………11
1.1.2.Поверхностные маркеры нейтрофилов…………………………….14
1.2.Функции нейтрофилов и их роль в системе иммунитета………………...17
1.2.1.Фагоцитоз…………………………………………………………….17
1.2.2.Дегрануляция………………………………………………………...20
1.2.3.Нейтрофильные внеклеточные ловушки…………………………..22
1.2.4.Активные формы кислорода в нейтрофилах………………............22
1.2.4.1.Пути образования и метаболиты АФК в нейтрофилах.............23
1.2.5.Роль нейтрофилов в патологических процессах…………………..26
1.3.Регуляция активности нейтрофилов……………………………………….28
1.4.Белки теплового шока………………………………………………………30
1.4.1.Семейство белков теплового шока 70 кДа. ……………………......32
1.4.2.Внутриклеточные функции HSP70…………………………………35
1.4.3.Внеклеточные функции HSP70…………………………………......40
1.4.4.HSP70 в нейтрофилах………………………………………………..46
1.5.HSP70 и окислительный стресс…………………………………………….47
1.6.Механизмы секреции HSP70…………………………………………….....48
1.7.Причины и иммунологические аспекты процесса старения …………….52
1.7.1.Основные теории развития старения……………………………….52
1.7.2.Ассоциированные с возрастом изменения в нейтрофилах…….....53
1.7.3. HSP70 при старении…………………………………………………54
II. Материалы и методы……………………………………………………….56
2.1. Реагенты……………………………………………………………………..56
2
2.2.Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов…………………………………………………………………………..57
2.3.Проточная цитофлуориметрия……………………………………………..59
2.3.1.Оценка жизнеспособности нейтрофилов…………………………..59
2.3.2.Цитометрический анализ внутриклеточного уровня HSP70……...60
2.3.3.Цитометрический анализ поверхностной экспрессии HSP70 и
маркеров дегрануляции………………………………………………………….60
2.3.4.Цитометрическое измерение внутриклеточной
продукции АФК………………………………………………………….....61
2.4. Анализ внутриклеточного содержания HSP70 методом Вестерн-
блоттинга…………………………………………………………………………61
2.5.Измерение продукции АФК с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции…………………………………………………………….62
2.6.Статистический анализ данных……………………………………………63
2.7.Измерение транскрипционной активности генов HSP70 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR)…...63
2.7.1.Проведение qRT-PCR………………………………………………..64
2.7.2.Статистическая обработка данных qRT-PCR……………………...65
2.8.Оценка внеклеточного уровня HSP70 с помощью ИФА…………………65
III. Результаты……………………………………………………………….....67
3.1.Внутриклеточное содержание HSP70 в интактных нейтрофилах в разных возрастных группах……………………………………………………………...67
3.2.Динамика изменения уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………………………..68
3.2.1.Транскрипционная активность генов белков HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………68
3.2.2.Анализ динамики внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока…………………………………………………71
3.3.Анализ экспрессии HSP70 в мононуклеарных клетках человека………..73
3
3.4.Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня HSP70 в
нейтрофилах под действием теплового шока………………………………….75
3.5.Воздействие гипертермии на уровень HSP70 в нейтрофилах в разных
возрастных группах… |
...........................................................................................81 |
3.6.Высвобождение HSP70 из нейтрофилов во внеклеточное пространство……………………………………………………………………..82
3.7.Анализ механизмов, регулирующих высвобождение HSP70 во внеклеточное пространство из нейтрофилов…………………………………..84
3.8.Спонтанная и индуцированная продукция АФК в разных возрастных группах…………………………………………………………………………...89
3.9.Анализ взаимосвязи между продукцией АФК и содержанием HSP70 в
нейтрофилах в разных возрастных группах…………………………………...92
IV. Обсуждение……………………………………………………………….....95
Выводы…………………………………………………………………………105
Список литературы…………………………………………………………...106
4
Список сокращений
АДФ – нуклеотид аденозиндифосфат
АПК – антиген-презентирующие клетки
АТФ – нуклеотид аденозинтрифосфат
АФК – активные формы кислорода
АФКDCF спонт – спонтанный внутриклеточный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах, измеренный с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA
АФКЛЗХ спонт – спонтанный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах,
измеренный с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции
АФКЛЗХ инд – индуцированная опсонизированным зимозаном продукция АФК в нейтрофилах, измеренная с помощью метода люминол-зависимой
хемилюминесценции
ЛЗХ – люминол-зависимая хемилюминесценция
СОД – фермент супероксид дисмутаза
ТШ – тепловой шок
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
BiP (binding immunoglobulin protein) – белок, связывающий
иммуноглобулины
BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) – катионный белок,
обладающий бактерицидной и LPS-связывающей активностью
CR1 (CD35) – рецептор к фрагменту системы комплемента 1
CXCL8 (IL-8) – интерлейкин 8
DCFH-DA (2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate) – проницаемый флуоресцентный зонд, уровень флуоресценции которого пропорционально зависит от концентрации H2O2
FcγRIIA (CD32) – Fc-рецептор для иммуноглобулинов
fMLP (formyl-1-methionyl-1-leucyl-1-phenylalanine) – хемоаттрактант
G-CSF – гранулоцитарный колонестимулирующий фактор
5
GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колонестимулирующий фактор
GPCR – суперсемейство трансмембранных гликопротеиновых
«серпентиновых» рецепторов, связанных с внутриклеточными GTP-
связанными белками
Hsc70 – конститутивный белок HSP70
HSF (heat shock factor) – транскрипционный фактор, инцициирующий транскрипцию генов HSP
HSP – белки теплового шока
Hsp70 – индуцируемый белок HSP70
HSP70 – семейство белков теплового шока 70 кДа HSP70базальный – содержание HSP70 в интактных нейтрофилах
HSP70ТШ – уровень HSP70, зарегистрированный сразу после окончания ТШ
ΔHSP70ТШ – параметр, который рассчитывается в виде разницы между
HSP70ТШ и HSP70базальный
IFNγ – гамма-интерферон
ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) – цитоплазматическая сигнальная последовательность
ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) – последовательность,
деактивирующая тирозиновые рецепторы
LFA-1 (CD11a/CD18) – высокоафинный рецептор адгезии
LPS – липополисахарид
LTВ4 – лейкотриен B4
Mac-1/ СR3 (CD11b/CD18) – рецептор адгезии
MAP – митоген-активированная протеинкиназа
mTOR (mammalian target of rapamycin) – сигнальный путь, ингибируемый
рапамицином
NET – нейтрофильные внеклеточные ловушки
O2* – супероксид анион-радикал
OH* – гидроксил радикал
6
PAF (platelet activating factor) - хемоаттрактант
PI3К – фосфатидилинозитол-3-киназа
PMA (phorbol meristat acetate) – активатор протинкиназы С
SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-fusion-protein attachment protein receptor) – семейство белков, обеспечивающих в слиянии мембран гранул и везикул с плазматической мембраной во время фагоцитоза и экзоцитоза
TLR (Toll-like receptors) – рецепторы врожденного иммунитета
TNFα/βR – рецептор фактора некроза опухоли
7
Введение
В настоящее время старение рассматривается как сложный биологический процесс, который протекает на фоне разнообразных молекулярных и функциональных изменений в организме. Самая известная из теорий, объясняющих причины старения, утверждает, что чрезмерное образование свободных радикалов, особенно активных форм кислорода
(АФК), совместно с нарушением защитной системы клеток от клеточного стресса, способствует старению организма [Harman, 1956]. С одной стороны АФК осуществляют элиминацию патогена и клиренс поврежденных тканей, а
с другой стороны, интенсивная продукция АФК усугубляет воспалительные реакции, оказывая повреждающее влияние не только на мишени, но и на собственные ткани организма.
Один из механизмов, обеспечивающих защиту клеток от неблагоприятных последствий действия АФК, связан с участием высоко консервативных белков теплового шока семейства 70 кДа (HSP70). Белки
HSP70 обладают широким спектром шаперонных функций и способствуют нормальному протеканию многих внутриклеточных процессов. Они обеспечивают устойчивость клеток к стрессу, участвуя в процессах дезагрегации, репарации и элиминации поврежденных в условиях стресса белков. Нарушение HSP70-опосредованных механизмов, связанных с поддержанием белкового гомеостаза, может быть одним из факторов,
ускоряющих старение.
Нейтрофилы, клетки врожденной иммунной системы, представляют важный источник АФК в организме и могут играть значительную роль в процессе старения. Известно, что нейтрофилы прямо или косвенно участвуют в патогенезе многих заболеваний, связанных с возрастом. В
нейтрофилах, несмотря на их низкую биосинтетическую активность, как и во всех эукариотических клетках, экспрессируются белки HSP70. В то же время,
работ, в которых бы изучались особенности экспрессии и роль HSP70 в
функционировании нейтрофилов, мало. Нет информации о возрастных
8
изменениях, связанных с уровнем внутриклеточных HSP70 в нейтрофилах.
До сих пор не ясно, участвуют ли HSP70 в регуляции процессов продукции АФК нейтрофилами.
Таким образом, актуальным является изучение в рамках одной работы вопросов, связанных с возрастными изменениями экспрессии HSP70 и
генерации АФК в популяции нейтрофилов, а также анализ взаимосвязи внутриклеточного уровня HSP70 с продукцией АФК. Немаловажным также представляется оценка способности нейтрофилов продуцировать внеклеточные формы HSP70, играющие иммунорегуляторную роль [De Maio, 2011]. Изучение этих вопросов может способствовать более глубокому пониманию процесса старения, а также позволить сформулировать стратегию коррекции патологических состояний, ассоциированных с возрастом, в
которых нейтрофилы играют существенную роль.
Цель исследования – изучение возрастных особенностей внутриклеточного содержания HSP70 и динамики стресс-индуцированных изменений уровня HSP70, а также анализ взаимосвязи этих изменений с продукцией АФК в нейтрофилах человека.
Задачи исследования:
1.Проанализировать содержание HSP70 в нейтрофилах человека в трех возрастных группах: молодые, пожилые и долгожители.
2.Исследовать динамику изменения внутриклеточного уровня HSP70 в
нейтрофилах в ответ на тепловой шок и выявить факторы, влияющие на эту динамику.
3.Сравнить динамику изменения внутриклеточного содержания HSP70
внейтрофилах в ответ на тепловой шок в разных возрастных группах.
4.Оценить спонтанную и индуцированную продукцию АФК в нейтрофилах в разных возрастных группах.
5.Изучить взаимосвязь содержания HSP70 и продукции АФК, а также ее возрастные особенности.
9
I. Обзор литературы
1.1. Нейтрофилы, их характеристика
Полиморфноядерные (сегментоядерные) гранулоциты, или нейтрофилы,
составляют преобладающую популяцию лейкоцитов в крови млекопитащих и реализуют первую линию защиты в системе врожденного иммунитета,
обеспечивая ответ организма на бактериальные и грибковые инфекции.
Нейтрофилы образуются в костном мозге из стволовых мультипотентных гемопоэтических клеток в миелопоэзе. Последовательные этапы дифференцировки миелоидных предшественников нейтрофилов (миелобласт,
промиелоцит и миелоцит) завершаются фазой созревания нейтрофилов в метамиелоцит, палочкоядерную и зрелую сегментоядерную формы, которые характеризуются ультраструктурными изменениями ядра и гранул. После цикла дифференцировки, который составляет в зависимости от степени активности процесса от 7 до 10 дней, около 10% созревших нейтрофилов попадают из костного мозга в кровоток, большая часть зрелых нейтрофилов депонируется в синусах костного мозга. Пополнение зрелых клеток в кровяном русле ежедневно составляет порядка 1011 клеток, а концентрация нейтрофилов в крови варьирует в диапазоне 3-5×106/мл. Доля циркулирующих в крови зрелых сегментоядерных нейтрофилов составляет от 45% до 75% от общего количества лейкоцитов человека. Эти клетки также представлены в виде регионального пула, выстилающего внутреннюю поверхность капилляров в ткани легких, печени и селезенки [Peters, 1998].
Средняя продолжительность циркуляции нейтрофилов в кровотоке составляет 8-20 ч, после чего, если их не активируют факторы воспаления,
нейтрофилы мигрируют в ткани. После миграции в ткани продолжительность жизни нейтрофилов составляет, как правило, 1-2 дня, затем они подвергаются спонтанному апоптозу и уничтожаются макрофагами, тем самым минимизируя повреждения ткани цитотоксическим содержимым своих гранул [Fox et al., 2010]. Пролонгация времени жизни нейтрофилов
10