4705
.pdfМИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«Воронежская государственная лесотехническая академия»
Чернодубов А.И.
БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЛЕСНЫХ КУЛЬТУРАХ
Воронеж 2014
УДК 630*232
Ч 49
Чернодубов, А.И. Биртехнология в лесных культурах [Электронный ресурс]: учеб. пособие / А.И. Чернодубов; Фед. агенство по образованию, Гос. образовательное учреждение высш. проф. образования, Воронеж. гос. лесотехн. акад. - Воронеж, 2014. - 26с.
Рассмотрены вопросы размножения древесных пород методами биотехнологии и генной инженерии. Выращивание посадочного материала в закрытом грунте, с закрытой корневой системой и выращивание крупномерного посадочного материала.
Пособие предназначено для аспирантов, обучающихся по специальности 06.03.01 – лесные культуры, селекция, семеноводство.
1 МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ДРЕВЕСНЫХ ПОРОД
Большинство древесных и кустарниковых пород размножаются семенным путем, что затрудняет воспроизводство отобранных экземпляров, особенно при отборе плюсовых деревьев по признакам роста, продуктивности и других полигенных признаков и показателей. Уровень наследования их при скрещиваниях не превышает обычно 10-20 %. При клоновой или вегетативной селекции негативную роль играет возраст маточников, снижение укореняемости черенков, явление депрессии роста черенковых саженцев. Отдельные быстрорастущие породы, в частности – белые тополя, плохо черенкуются. Возникает необходимость поиска других методов и способов размножения.
Решить эти проблемы возможно с помощью нового метода вегетативного размножения – микроклонирования или in vitro на основе культивирования клеток, тканей, органов растений на питательных средах в стерильных условиях. Основоположниками данного метода были П. Ф. Уайт (США) и Р. Готре (Франция). В России это направление развивалось сначала на травянистых растениях в институте физиологии растений (Курсанов А.А., Бутенко Р.Г.). С древесными растениями исследования проводились с 1984 года в США с сосной ладанной, затем Канаде, Великобритании. В нашей стране в НИИ Москвы, С-Петербурга, Уфы, Красноярска, Воронежа и других регионах. Была детально разработана методика культивирования растений in vitro не только в лабораторных, но и практических целях (рис. 1).
Рис.1. Растения дуба черешчатого, выращенного путем микроклонального размножения (фото М.Ю. Нечаевой)
Микроклональное размножение изолированных клеток, тканей и органов проводится с целью:
- ускоренного размножения и оздоровления ценного селекционного материала, т.е. максимальное получение нового селекционного материала. Коэффициент размножения для древесных пород может достигать 104-105. Использование меристем позволяет оздоровить от вирусов и инфекций;
-использование изолированных клеток и тканей в селекции растений. Это направление позволяет сохранить ценный генофонд, размножить ценный гибридный материал, получения гаплоидных растений, соматическая гибридизация, культура изолированных протопластов и т.д.
-для получения веществ вторичного происхождения (эфирные масла, алкалоиды, гликозиды, стероиды и другие), используемые в фармакологии, парфюмерии, косметологии, на основе суспензионных культур.
Древесные породы – самые сложные для культивирования in vitro в силу целого комплекса различных факторов (болезни, бактерии, терпены, фенолы и т.д.). Все это затрудняет получение новых растений и только микроклональное размножение дает возможность воспроизвести растение, генетически идентичное исходному.
1.1Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения
Успешность размножения зависит от ряда факторов: физиологических особенностей растения, химических и физических условий культивирования.
При выборе материнского растения необходимо учитывать его генотип, так как успешность размножения зависит от родовых и сортовых особенностей исходных эксплантов. Древесные породы, успешно размножающиеся вегетативным путем имеют высокую регенерационную способность и в культуре тканей (тополь, береза, ива, эвкалипт). Хвойные породы более трудный объект для размножения. Родовые особенности при размножении видов сосен и елей проявляются в более высоком образовании адвентивных почек в 2-3 раза больше у всех видов сосен, чем у елей. У отдельных сортов тополей проявляется стабильно высокая укореняемость in vitro.
Большое значение имеет физиологический возраст экспланта. Ткани проростков семян имеют более высокую регенерацию, чем у этих же
взрослых растений. Для приодаления этого фактора проводят омоложение растений путем подрезки растений, повторное черенкование, перепрививку, обработку стимуляторами роста.
Немаловажное значение имеет время или сезон изоляции экспланта. Введение в фазу активного роста, которая у древесных растений составляет 30 …45 дней, значительно увеличивает количество и укоренение побегов, чем в фазу покоя.
Одним из основных факторов, обеспечивающих успешность клонального размножения, является правильный подбор питательной среды. Химический состав, физические свойства питательной среды должны соответствовать этапам клонального размножения. В состав питательных сред входят гормоны, витамины, углеводы, минеральные соли. В качестве углеводов применяют сахарозы, фруктозы, глюкозы, различной концентрации. Чаще всего используют среды Мурасеге и Скуга, а также среды ВТМ и WPM.
Кислотность среды должна быть нейтральная, pH в пределах 5,6…5,8. Освещенность вначале колеблется от 1000 до 3000 лк, продолжительность 16 часов в сутки. При подготовке к переносу растений в почву интенсивность освещения повышают до 10 тыс. лк. Температура варьирует 22…26 градусов С днем и 18…22 градусов С ночью. Влажность воздуха должна составлять 60…70 %.
Для оздоровления посадочного материала от грибной инфекции,
вирусов, бактерий производят обработку повышенными температурами (от 23 до 37 °С), а также фунгицидами.
У древесных и кустарниковых пород для их успешного клонального культивирования необходим индивидуальный видовой подбор всех вышеуказанных факторов.
1.2 Этапы клонального размножения
Клональное микроразмножение включает в себя четыре последовательных этапов (рис. 2):
а) элонгация или выбор растения-донора, изолирование экспланта, получение хорошо растущей стерильной культуры;
б) собственно микрочеренкование с целью получения максимального количества микропобегов;
в) укоренение размноженных побегов in vitro, адаптация их к почвенным условиям, а при необходимости – сохранение растенийрегенерантов;
г) выращивание растений-регенерантов в условиях теплицы, перевод в открытый грунт.
Рис.2. Этапы клонального размножения березы повислой (фото Шестибратова К.А.).
На первом этапе главная задача – получение стерильной хорошо растущей культуры, добиться развития меристем и сформировать первичные побеги. Для этого проводят поверхностую стерилизацию растений с помощью растворов хлорили ртутьсодержащих растворов. После дезинфекции проводят тщательную промывку стерильной дистиллированной водой.
На первом этапе культивирования чаще всего применяют питательную среду Мурасиге и Скуга, добавляя различные биологически активные вещества (ауксины, цитокинины), антиоксиданты (аскорбиновую кислоту, глютатион и др.). Продолжительность данного этапа 1-2 месяца.
На втором этапе главная цель – получение необходимого количества микропобегов. Используя также среду Мурасиге и Скуга и добавляя регуляторы роста – БАП (1…10 мг/л), ИУК и НУК (0,1…0,5 мг/л) возможно добиться получения максимального количества побегов. Иногда для обеспечения стабильного коэффициента мультипликации используют
минимальное количество гормонов. В зависимости от количества необходимых микропобегов длительность этапа составляет не менее 3-4 недель.
Третий этап – укоренение микропобегов и адаптация их к почве. Это самый трудоемкий и ответственный этап, от которого зависит успех всего клонального микроразмножения. Для индукции корней in vitro меняют питательную среду, уменьшают в несколько раз концентрацию макросолей, сахарозы, полностью исключают цитокинины. Для индукции корнеобразования применяют ауксины – ИМК, ИУК, НУК выдерживая побеги в стерильной среде ауксинов или добавляют в среду и культивируют на ней в течение 3-4 недель.
Четвертый заключительный этап – выращивание растений в теплице, перевод их в открытый грунт (рис.3). Обычно эту работу приурачивают к весне или началу лета. Растения-регенеранты извлекают из сосудов, отмывают корни от остатков агара и высаживают в почву. Состав субстрата подбирают индивидуально для каждого вида, предварительно его стерилизуют при 85…90 градусах С в течение 1-2 часов, помещают в горшочки и выставляют в мини-теплицы при температуре 20…25 градусов С, освещенности до 5 тыс. лк, влажности 65-90 %.
Рис.3. Выращивание растений в теплице, перевод в открытый грунт (фото Шестибратова К. А.).
Рис. 4. Культуры березы повислой, выращенные
из растений-регенерантов
1.3 Методы микроразмножения
Рассмотренный выше метод клонального микроразмножения основан на снятии апикального доминирования и может быть достигнут удалением верхушечной меристемы или добавлением в среду цитокининов, что позволяет индуцировать развитие пазушных почек или стимулирует развитие пазушных побегов других более высоких порядков, которые можно черенковать, доращивать на безгормональной среде и укоренять. Этот метод широко применяется при размножении тополя, березы, ивы, ольхи, ясеня и других.
Второй метод основан на индукции возникновения адвентивных почек из любых органов и тканей растений на питательных средах в состав которых цитокинины с ауксинами в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве ауксинов используют ИУК и НУК. Этим способом из зрелых и незрелых зародышей в Канаде успешно размножается ель.
Третий метод основан на дифференциации из соматических клеток
зародышеподобных структур, напоминающие зародыши, возникающие в половом процессе из зигот. Этот метод называется – соматическим эмбриогенезом. Соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка. Эмброиды размножаются самопроизвольно. При их формировании происходит дифференциация клеток под влиянием ауксина 2,4-Д и их превращение в эмбриональные. Соматические зародыши в конечном счете проходя через определенные стадии развития образуют проростки. Они представляют полностью сформированное растение, которое заключают в искусственную оболочку и получают искусственные семена. Среди древесных семена получены у ели, лип, орехов (рис. 20).
Четвертый метод клонального размножения – дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной культуре.
Этот метод используется редко, так как при длительном культивировании каллуса происходят генетические изменения. Но представляет интерес для
селекционеров |
с |
целью повышения генетического разнообразия и |
дальнейшего отбора |
новых форм. |
1.4 Генетическая инженерия
Генетическая инженерия является одним из разделов молекулярной генетики и используется для целенаправленного создания in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клеткехозяине.
Рис.5. Искусственные семена, полученные методом соматического эмбриогенеза (основные этапы : 1- получение соматических эмбрионов; 2 – инкапсуляция; 3 – проращивание; 4 – проростки из искусственных семян)
(фото Шестибратова К.А.)
Генетическая инженерия состоит из двух разделов – генной и геномной инженерии. Генная инженерия основана на введении в геном реципиентной клетки одного тили нескольких чужеродных генов и формирования новых регуляторных связей. Геномная инженерия оказывает более глубокое вмешательство в геном, приводящее к образованию новых не встречающихся в природе организмов (рис. 5,6).